番茄红素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤过程中凋亡和自噬的作用

摘要

目的:
　　探讨番茄红素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤过程中凋亡和自噬的作用。
　　方法：
　　分组:采用80只SPF级SD大鼠，随机分为假手术组，肝缺血再灌注组、番茄红素治疗组，番茄红素+3-ma抑制组，每组20只。
　　建立大鼠肝脏部分缺血再灌注模型:通过大鼠腹腔内注射2％戊巴比妥钠麻醉(0.2ml/100g)进行麻醉。取腹部正中纵行切口入腹，充分暴露腹腔内脏器后，游离出第一肝门。使用无损显微血管夹夹闭肝左、中叶脉管的共干40min，使得肝左叶及肝中叶缺血，以实现70％的肝脏组织缺血。腹壁切口覆盖生理盐水纱布，达到预定缺血时间后松开血管夹，随后关腹。
　　样本的采集和观察指标的测定:分别在缺血再灌注后1h、6h、12h、24h，予以取材检测各项生化指标。采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中谷氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，运用双抗体夹心ELISA法定量测定大鼠血清检测相关细胞炎性因子TNF-α，IL-6，Western免疫印迹方法检测肝脏组织中Beclin1，bax;通过苏木精-尹红(HE)染色观察各组肝脏组织病理学改变。两组计量资料间比较用T检验，计数资料间比较行卡方检验。P值＜0.05认为有统计学差异，所有统计分析均使用正版SPSS19.0统计分析软件完成。
　　结果：
　　1.血清ALT和AST水平的变化:与假手术组比较缺血再灌注组的血清中ALT和AST水平显著升高(P＜0.05)，其在再灌注6h后达到顶峰，然后逐渐下降，再灌注12、24h时血清ALT和AST水平逐渐下降。番茄红素治疗组与缺血再灌注组比较，番茄红素+3-ma抑制组和番茄红素治疗组血血清ALT和AST水平相对升高(P＜0.05)。
　　2.血清中TNF-α，IL-6炎性因子的水平变化:在肝脏缺血再灌注组大鼠血清中显著升高，于再灌注后6h达到顶峰，而后在12h，24h逐渐下降，治疗组显著低于缺血再灌注组，且再灌注后6h有显著差异(P＜0.01)。而抑制组中TNF-α，IL-6在各时段均高于治疗组，于再灌注后6h有显著差异(P＜0.01)
　　3.肝脏细胞凋亡蛋白表达水平的变化:肝脏凋亡相关蛋白bax的表达显示，肝脏缺血再灌注组大鼠再灌注后bax的表达水平上升，而番茄红素治疗组肝脏bax的表达相比降低，仅再灌注1h时两组间无统计学差异。而抑制组与治疗组相比降低了bax的表达，仅再灌注1h时两组间无统计学差异。
　　4.肝脏细胞自噬蛋白表达水平的变化，通过免疫印迹检测肝脏自噬相关蛋白Beclin1、蛋白的表达显示，Beclin1在再灌注后6h时表达达到峰值，在12h和24h逐渐降低，番茄红素治疗组与缺血再灌注对照组相比增加了Beclin1的表达，而加入自噬抑制剂3-MA，与治疗组相比抑制了Beclin1表达，显示番茄红素促进肝脏缺血再灌注肝细胞Beclin1表达水平，促进了自噬。
　　5.肝组织HE染色观察:假手术组肝脏细胞形态正常，肝小叶、中央静脉、汇管区结构清晰，肝细胞索排列整齐。肝脏缺血再灌注模型对照组大鼠与番茄红素治疗组各时间点相比，肝组织纹理不清，出现各种程度的水肿、坏死，以再灌注后6h时间点差异最为显著，肝细胞出现空泡变性和坏死，胞核固缩并深染，而番茄红素各治疗组肝脏组织病理形态学明显改善。
　　结论：
　　发现番茄红素预处理可以通过提高大鼠缺血再灌注肝脏自噬水平，降低血清ALT/AST水平并减轻炎症反应以及减少肝细胞凋亡从而起到保护缺血再灌肝损伤。进一步通过加入自噬阻断剂3-甲基腺嘌(3-MA)，发现削弱了番茄红素这种保护作用。在肝脏缺血再灌注损伤中，说明自噬的出现和作用与组织缺血情况、受损程度和作用时间有关，缺血时间短、对机体的打击较弱，自噬激活，自噬在一定程度上可以减少细胞凋亡的发生。本研究表明番茄红素具有通过促进自噬保护大鼠缺血再灌注肝损伤作用。该结果为番茄红素保护肝脏缺血再灌注损伤提供了新的理论依据，具有重要的临床应用价值。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

材料与方法

1．实验动物与实验器材

2．实验步骤

实验结果

1．组织形态学观察肝脏组织结构

2．肝功能的血清酶ALT／AST检测结果

3 假手术组、缺血再灌注组、治疗组、抑制组不同时间点相关细胞炎性因子

讨论

结论

参考文献

综述 线粒体自噬在缺血再灌注损伤中的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章

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