鸡快慢羽候选基因的筛选

摘要

鸡的快慢羽可用于雌雄鉴别，且与生产性状有一定关联。已知鸡的快慢羽基因与性染色体Z上的内源性反转录病毒ev21连锁。在快羽鸡中，唯一的ev21插入位点位于催乳素受体基因(PRLR)和精子鞭毛编码蛋白2(SPEF2)基因序列之间。而在慢羽鸡中，两个ev21插入位点中的一个被ev21占据。在这两个插入位点之间为部分重复的PRLR(duplicatedPRLR，dPRLR)和SPEF2(duplicated SPEF2，dSPEF2)所形成的融合基因（dPRLR/dSPEF2），而在位点的两侧仍为PRLR和SPEF2基因序列。由于目前缺乏强有力的证据，这三个基因（即PRLR，SPEF2和dPRLR/dSPEF2）均是鸡快慢羽性状控制基因的候选者。为了进一步对这三个候选基因进行甄别。本研究首先对实验用慢羽雏鸡中融合基因拼接处的核酸序列进行了PCR扩增及测序，确定融合基因序列的拼接方式与已报道的拼接方式是否相同;其次，利用链特异性RT-PCR确定慢羽鸡融合基因是否转录，且是否存在双向转录而形成具有表达调控作用的双链RNA分子;最后，利用实时荧光定量技术，测定三个候选基因在快慢羽雏鸡皮肤中的表达水平，为进一步甄别快慢羽性状控制基因提供科学依据。数据显示:1.利用融合基因特异性引物，以苏禽绿壳蛋鸡和海塞克斯慢羽鸡的基因组DNA为模板，本研究获得了一个1，429bp大小的PCR扩增片段。测序分析表明，融合基因由PRLR外显子12下游578 bp处和SPEF2内含子4下游1，543bp处反向拼接而成，与已报道的拼接序列不同，提示拼接序列可能存在品种特异性。2.经反转录定量PCR（RT-qPCR）测定，dPRLR/dSPEF2融合基因可在且仅在慢羽鸡皮肤中转录。通过链特异性RT-qPCR，本研究进一步确定该融合基因是双向转录的，可形成一个双链RNA分子。因此，该融合基因可能通过形成的双链RNA分子来调控邻近基因的表达，从而影响鸡羽毛生长的速度。不过，此推测还有待深入研究加以验证。3.利用实时荧光定量PCR技术对1日龄快慢羽公/母鸡中PRLR、SPEF2和dPRLR/dSPEF2基因在皮肤中的表达水平进行测定，数据表明公母绿壳蛋鸡和公海塞克斯鸡皮肤中的PRLR转录本丰富度在快慢羽之间没有显著差异，在同一羽型的个体间差异较大。因此，PRLR的表达与快慢羽表型形成没有直接关系，提示该基因不是鸡快慢羽候选基因的有力竞争者。与此相反，数据表明母绿壳蛋鸡皮肤中SPEF2的转录本丰富度在快慢羽之间存在极显著差异(P＜0.01)，且慢羽是快羽的16倍，提示SPEF2是快慢羽候选基因的有力竞争者。此外，融合基因(dPRLR/dSPEF2)在皮肤中的表达水平仅为PRLR的2.9％左右，提示融合基因不可能以PRLR或SPEF2相同的基因功能来影响羽毛的生长速度。综上所述，PRLR基因不是理想的鸡快慢羽候选基因，而融合基因dPRLR/dSPEF2和SPEF2基因是候选基因的有力竞争者。对它们的功能、作用机制以及表达调控进行研究将有助于阐明鸡快慢羽形成的分子基础。

目录

论文说明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1．1 鸡的快慢羽表型判定

1．2 鸡的快慢羽性状及遗传

1．3 羽速基因对鸡生产性状的影响

1．3．1 对生长速度和体重的影响

1．3．2 对产蛋性能的影响

1．3．3 对生活力和抗病性的影响

1．4 催乳素受体(PRLR)的研究进展

1．4．1 催乳素受体(PRLR)与动物繁殖的关系

1．4．2 PRLR基因基本结构、表达及多态性研究进展

1．5关于SPEF2的研究

1．6 关于鸡dPRLR／dSPEF2的研究

1．7 研究目的

第二章 鸡融合基因的拼接方式检测及鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 仪器和试剂

2．1．3 实验样品采集

2．1．4 引物的设计与合成

2．1．5 酚氯仿提取DNA

2．1．6 琼脂糖凝胶电泳

2．1．7 鸡融合基因拼接处的鉴定PCR

2．2 结果与分析

2．2．1 基因组中融合基因拼接处PCR扩增

2．2．2 基因组中融合基因拼接处的序列测定

第三章 鸡融合基因的表达及其方式鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 试验动物

3．1．2 仪器和试剂

3．1．3 实验样品采集

3．1．4 引物的设计与合成

3．1．5 样品RNA的抽提

3．1．6 样品cDNA合成

3．1．7 特异性引物逆转录cDNA合成

3．1．8 RT-PCR验证慢羽鸡中融合基因的转录

3．1．9 RT-PCR验证慢羽鸡中融合基因的双向转录

3．2 结果与分析

3．2．1 慢羽鸡中融合基因的转录表达

3．2．2 慢羽鸡中融合基因拼接处的转录序列测定

3．2．3 慢羽鸡中融合基因双向转录的验证

第四章 鸡快慢羽候选基因的甄别

4．1 材料与方法

4．1．1 试验动物

4．1．2 仪器和试剂

4．1．3 实验样品采集

4．1．4 引物的设计与合成

4．1．5 样品RNA的抽提

4．1．6 样品cDNA的合成

4．1．7 待测样品的待测基因实时荧光定量PCR

4．1．8 统计方法

4．2 结果与分析

4．2．1 快慢羽鸡皮肤中PRLR基因在的表达水平差异

4．2．2 慢羽鸡皮肤中融合基因和PRLR的表达水平比较

4．2．3 快慢羽鸡皮肤中SPEF2基因的表达水平差异

第五章 讨论与结论

参考文献

附表

致谢

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