土壤耐药菌及耐药基因丰度与多样性对高温处理猪粪施用的短期响应

摘要

随着畜禽养殖过程兽用抗生素的大量使用，养殖动物体内诱导出大量耐药细菌及耐药基因，并随动物粪便排出体外，造成养殖区及周边环境的严重污染。由于畜禽养殖废物主要通过农业施肥方式消纳，耐药菌及耐药基因农田传播与扩散风险已引起世界范围的广泛关注，建立有效的畜禽粪便耐药菌及耐药基因污染的处理方法，对于控制畜禽养殖废物耐药菌及耐药基因的环境生物风险至关重要。目前，高温堆肥方式作为畜禽废物无害化处理及资源化利用的主要途径，有效地消减了粪源病原菌及寄生虫的环境传播，但对于粪源耐药基因的处理效果及其在农田土壤中的扩散传播机制缺乏深入研究。本文以畜禽废物中普遍存在的四环素耐药菌及耐药基因为对象，分析了高温灭菌处理对猪粪中6种典型四环素耐药基因丰度的影响，并运用室内好气及厌气培养方法，研究了高温灭菌+快速降温(B)、高温灭菌+缓慢降温(C)、不灭菌(A)等3种处理猪粪施用对土壤四环素耐药菌及耐药基因丰度与多样性的短期影响。主要研究结果如下:
　　1、分别采用四环素平板计数法及实时荧光定量PCR技术对两种高温处理(60℃高温处理12h～96h、121℃高温灭菌0.5h)猪粪耐药菌数量及6种四环素耐药基因丰度进行了检测。结果表明:(1)高温灭菌处理可彻底杀灭猪粪中耐药菌，而60℃高温处理虽然可明显降低猪粪耐药菌数量，但处理96h后存活量仍高于103cfu/克干粪。(2)60℃高温处理及高温灭菌处理对粪源tetB、tetC、tetM、tetO、tetT、tetZ等6种四环素耐药基因的消减幅度分别为1和1～4个数量级，且不同种类耐药基因对高温耐受性存在明显差异，高温处理后猪粪中仍然残留大量四环素耐药基因。
　　2、采用稀释平板法对各施肥处理土壤四环素耐药细菌数量进行了测定，结果表明:(1)与对照相比，无论好气还是厌气条件，新鲜猪粪施用均提高了整个培养时期土壤各水平耐药菌数量及比例，而高温灭菌猪粪施用提高了整个培养时期普通耐药菌数量及比例;高温灭菌猪粪施用提高了好气培养条件下整个时期土壤高水平耐药菌数量及比例，而厌气条件下高水平耐药菌数量及比例则相对较低。(2)与新鲜猪粪施用相比，好气条件下，高温灭菌猪粪施用提高了整个培养时期土壤各水平耐药菌数量及比例;而厌气条件下，高温灭菌猪粪施用则不同程度降低了各水平耐药菌数量及比例。(3)好气条件下各处理猪粪施用土壤中各水平耐药菌数量及比例均高于厌气条件。
　　3、利用实时荧光定量PCR技术对不同施肥处理土壤tetB、tetC、tetM、tetO、tetT、tetZ等6种四环素耐药基因丰度动态进行检测，结果显示:(1)好气条件下，相对于CK，新鲜猪粪施用总体上提高了整个培养时期土壤所检测6种耐药基因丰度，且促进了整个培养过程tetM、tetO基因相对丰度的提高，而tetB、tetC、tetT、tetZ等4种耐药基因相对丰度在不同培养时期分别表现为增-增-减-减趋势;高温灭菌猪粪施用总体上提高了整个培养时期土壤tetM、tetO、tetT基因的丰度，且提高了tetO基因的相对丰度，但对tetM、tetT基因的相对丰度没有明显影响;高温灭菌猪粪施用总体上降低了整个培养时期土壤tetB基因的丰度及相对丰度。高温灭菌猪粪施用降低了培养初期土壤tetC、tetZ基因的丰度及相对丰度，随着培养时间延长，tetC基因丰度及相对丰度始终低于CK，而tetZ基因丰度及相对丰度均有提升。(2)厌气条件下，与CK相比，新鲜猪粪施用提高了整个培养时期土壤6种耐药基因丰度及相对丰度;高温灭菌猪粪施用总体上提高了整个时期土壤tetM、tetO、tetT基因的丰度及相对丰度，tetB、tetC、tetZ基因的丰度及相对丰度均在培养初期低于CK，并且随着培养时间延长逐渐提升。(3)无论是好气还是厌气条件下，与新鲜猪粪施用相比，高温灭菌猪粪施用总体降低了各培养时期土壤tetB、tetC、tetM、tetO、tetT、tetZ基因丰度及相对丰度。(4)与好气条件相比，厌气条件有利于不同施肥处理土壤tetB、tetC、tetT基因丰度及相对丰度的提高;厌气条件下各处理土壤tetM、tetO基因丰度与好气条件下基本一致，而相对丰度却高于好气培养土壤;厌气条件抑制了tetZ基因丰度及相对丰度的提高。
　　4、采用普通PCR技术对新鲜猪粪及各施肥处理土壤DNA提取样本中具有外排泵机制(29种)、核糖体保护机制（11种）、修饰/钝化机制（3种）及未知机制（1种）的共计44种四环素耐药基因进行了定性检测，结果显示:(1)外排泵机制与核糖体保护机制耐药基因多样性在各检测样本中较为普遍。(2)由各样本耐药基因总检出率可知，1）CK具有较丰富的耐药基因多样性;2）猪粪的施用大幅提高土壤中耐药基因种类的覆盖率，其中，高温处理猪粪施用与新鲜猪粪施用对土壤耐药基因覆盖率影响差异不明显;(3)从耐药机制类型看，不同处理猪粪施用(A、B、C)分别使土壤外排泵机制耐药基因覆盖率提高了27.6％、24.1％、27.6％，核糖体保护机制均提高36.3％，而对修饰/钝化机制与未知机制耐药基因的覆盖程度没有影响。(4)比较各施肥处理土壤耐药基因种类发现:1）tetA、tetB、tetC、tetL、tetZ、tet33、tet40、tet42、tetAB(46)、tcr3(C)、tetO、tetB(P)、tet32等耐药基因存在于上述所有处理，是猪粪与土壤环境广泛分布的四环素耐药基因;2)tetG、tetH、tetA(P)、tet31、tet39、tetT、tetW、tet36、tetS、tet35、tetJ、tet30、tet41、otrC、otrA等耐药基因广泛存在于施肥处理土壤，而在CK中未检测到，说明这些基因极可能是经由施肥进入土壤。3）tetE、tetM、tetQ等基因存在于猪粪中，而各施肥处理土壤均未检测到，说明这些基因经由施肥进入土壤并发生明显传播与扩散的能力可能很小。
　　5、利用稀释平板分离法对各施肥处理土壤四环素耐药细菌进行了分离纯化，依据菌落特征共分离获得463株耐药菌株。通过HinfⅠ酶切分型及菌落特征的进一步比较，剔除重复后对各菌株进行16SrDNA V3区测序，经BLAST序列同源性检索比对剔除重复后共计获得199株耐药细菌，分属于45个属。依据各菌株来源发现:(1)广泛分布于土壤、猪粪、施用猪粪土壤中的四环素耐药细菌包括Bacillus、Rhodococcus、Stenotrophomonas等3个属;(2)土壤中特有的四环素耐药细菌包括Agromyces;(3)猪粪中特有的四环素耐药细菌包括Pseudochrobactrum、Facklamia、Brevibacterium、Zimmermannella、Kurthia、Empedobacter、Comamonas、Halophilic等8个属;(4)高温处理猪粪施用的土壤中特有的四环素耐药菌包括Shewanella、Brevibacillus、Sph ingopyxis、Oerskovia、Brevundimonas、Chitinophaga、Solibacillus、Achromobacter等8个属;(5)各处理猪粪施用土壤中共有而CK中不存在的四环素耐药细菌包括Variovorax、Streptomyces、Pedobacter、Acinetobacter等4个属。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 抗生素在畜禽养殖中的应用现状

2 畜禽粪便中抗生素及耐药基因残留

3 畜禽粪便利用方式及其对环境耐药性的影响

4 环境耐药性的研究方法

4．1 传统的研究方法

4．2 分子生物学的研究方法

5 研究的创新点

第二章 高温处理对猪粪中耐药细菌及耐药基因丰度的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 高温灭菌处理对猪粪耐药菌数量的影响

2．2．2 高温灭菌处理对猪粪中耐药基因丰度的影响

2．2．3 模拟高温堆肥处理对猪粪中耐药菌数量的影响

2．2．4 模拟高温堆肥处理对猪粪中耐药基因丰度的影响

2．3 讨论

第三章 高温处理猪粪施用对土壤耐药菌数量的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 检测方法

3．2 结果与分析

3．2．1 高温处理猪粪施用土壤细菌总量的动态变化

3．2．2 高温处理猪粪施用土壤好气培养过程普通耐药菌数量的动态变化

3．2．3 高温处理猪粪施用土壤好气培养过程高水平耐药菌数量的动态变化

3．2．4 高温处理猪粪施用土壤厌气培养过程普通耐药菌数量的动态变化

3．2．5 高温处理猪粪施用土壤厌气培养过程高水平耐药菌数量的动态变化

3．3 讨论

第四章 高温处理猪粪施用对土壤四环素耐药基因丰度的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 实验方法

4．2．1 高温处理猪粪施用对土壤16SrDNA丰度的影响

4．2．2 高温处理猪粪施用对好气培养过程土壤tetB基因丰度的影响

4．2．3 高温处理猪粪施用对好气培养过程土壤tetC基因丰度的影响

4．2．4 高温处理猪粪施用对好气培养过程土壤tetM基因丰度的影响

4．2．5 高温处理猪粪施用对好气培养过程土壤tetO基因丰度的影响

4．2．6 高温处理猪粪施用对好气培养过程土壤tetT基因丰度的影响

4．2．7 高温处理猪粪施用对好气培养过程土壤tetZ基因丰度的影晌

4．2．8 高温处理猪粪施用对厌气培养过程土壤tetB基因丰度的影响

4．2．3 高温处理猪粪施用对厌气培养过程土壤tetC基因丰度的影响

4．2．4 高温处理猪粪施用对厌气培养过程土壤tetM基因丰度的影响

4．2．5 高温处理猪粪施用对厌气培养过程土壤tetO基因丰度的影响

4．2．6 高温处理猪粪施用对厌气培养过程土壤tetT基因丰度的影响

4．2．7 高温处理猪粪施用对厌气培养过程土壤tetZ基因丰度的影响

4．3 讨论

第五章 高温处理猪粪施用的土壤中耐药菌、耐药基因多样性研究

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 猪粪及不同处理猪粪施用土壤四环素耐药基因多样性

5．2．2 猪粪及各处理土壤四环素耐药菌多样性

5．3 讨论

第六章 全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明