牛单核细胞趋化蛋白1单克隆抗体的制备及其初步应用

摘要

单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趋化因子CC亚家族的一员。MCP-1主要趋化单核细胞和T淋巴细胞，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，从而在机体防御、慢性炎症及抗肿瘤等方面起重要作用。血液中的单核细胞在特异的趋化因子作用下，发生迁移并聚集在不同病变组织中发挥重要的生物学效应，如吞噬和杀伤病原微生物，递呈抗原及分泌多种生物活性物质等。本研究克隆表达了牛MCP-1基因并制备了牛MCP-1单克隆抗体，为MCP-1在治疗炎症疾病、免疫诊断研究中提供了重要的生物材料。
　　1.牛MCP-1基因的克隆及表达
　　用ConA刺激健康荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞，并提取细胞总RNA，以RT-PCR方法反转录为cDNA，再以cDNA为模板成功扩增到所需不含信号肽(BoMCP-1)和含信号肽(BoPreMCP-1)目的基因，同时还扩增了GFP-BoPreMCP-1基因。将BoMCP-1基因分别与表达载体pET-30a(+)和pGEX-6p-1相连接构建重组质粒，将BoPreMCP-1基因与载体pVAX1相连构建重组质粒，并进行双酶切以及测序鉴定，鉴定结果通过DNA star软件分析均正确，无任何突变。构建成功的重组质粒分别命名为pET-30a-BoMCP-1、pGEX-6p-1-BoMCP-1、pVAX1-BoPreMCP-1和pVAX1-GFP-BoPreMCP-1。将原核表达载体转入宿主菌后，经0.5 mM/L IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析，出现预期的目的条带，条带大小分别为17 kDa和36 kDa左右。通过免疫亲和层析法进行蛋白的纯化，Western blot结果显示纯化蛋白具有良好的免疫反应性，说明重组蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1均成功获得表达。
　　2.牛MCP-1单克隆抗体的制备与初步应用
　　将纯化得到的重组蛋白rHis-BoMCP-1免疫6周龄BALB/c小鼠，经3次免疫后，运用淋巴细胞杂交瘤技术融合细胞，以纯化重组蛋白rGST-BoMCP-1为检测原，运用间接ELISA方法筛选阳性克隆，经过3次亚克隆后，共获得3株能稳定分泌特异性BoMCP-1单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为3D10、4G9和6F5。亚型鉴定结果显示3D10和4G9单抗为IgA亚型，6F5为IgG1亚型。间接ELISA测定效价结果显示6F5单抗上清效价为3200，3D10和4G9上清效价均为12800;制备上述三株单抗腹水，间接ELISA测定其效价，除了6F5的腹水效价较低为32000，3D10和4G9腹水效价分别为256000和512000。间接ELISA还显示除6F5单抗与毕赤酵母表达的商品化牛MCP-1的反应性一般，3D10和4G9单抗与毕赤酵母表达的商品化牛MCP-1的反应性较好。Western blot结果显示所获得的3株单抗均与融合蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1发生反应。构建成功的pVAX1-GFP-BoPreMCP-1转染293T细胞后，间接免疫荧光分析单抗与MCP-1蛋白的反应性，结果显示3株单抗均与真核表达的GFP-BoPreMCP-1有很好的反应性。
　　应用流式细胞术结合胞内染色技术分析单抗与天然牛MCP-1蛋白的反应性，首先对3株抗体进行流式细胞术方法的筛选优化:①选择两种不同的细胞的刺激剂ConA和LPS;②设置不同的抗体浓度，从而得到比较稳定的流式结果。结果显示只有4G9与天然BoMCP-1有较好的反应性。将4G9抗体应用于牛结核病的诊断，建立基于特异性抗原的流式细胞检测方法。采集经过TST和牛结核γ干扰素ELISA检测试剂盒验证的牛结核阳性和牛结核阴性的牛外周血，用特异性抗原ESAT-6/CFP-10重组蛋白刺激牛外周血单个核细胞后，使用4G9单抗进行流式细胞术检测，结果表明基于单抗4G9的流式细胞术具有较好的应用潜能。

目录

摘要

符号说明

综述 MCP-1的生物学特性及其在感染性疾病中的诊断价值

1．2 MCP-1的氨基酸结构

1．4 MCP-1的生物学功能

2．2 MCP-1与动脉粥样硬化

2．3 MCP-1与肿瘤

2．4 MCP-1和免疫应答

3 针对MCP-1的疾病治疗

3．2 MCP-1的拮抗剂

3．3 CCR2的拮抗剂

参考文献

第一章 牛MCP-1基因的克隆及表达

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 BoMCP-1基因的克隆

2．2 表达载体的构建与鉴定

2．3 原核表达菌的构建

2．4 重组真核表达载体pVAX1-BoPreMCP-1和pVAX-GFP-BoPreMCP-1的构建

2．5 重组表达菌的诱导表达及表达产物的纯化

2．6 重组菌诱导表达产物的鉴定及Western blot分析

3 结果

3．1 目的基因扩增和原核表达质粒的鉴定

3．2 重组菌诱导表达及纯化产物的SDS-PAGE与Western blot分析

4 讨论

参考文献

第二章 牛MCP-1单克隆抗体的制备及其初步应用

1 材料与试剂

1．1 生物材料

1．2 生物试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 实验动物

2 方法

2．1 动物的免疫

2．2 细胞融合

2．3 阳性杂交瘤细胞的筛选

2．4 阳性杂交瘤细胞的克隆化

2．5 阳性杂交瘤细胞的冻存和复苏

2．6 单克隆抗体腹水的制备

2．7 牛MCP-1单克隆抗体的鉴定

2．8 牛MCP-1单克隆抗体在流式中的初步应用

3 结果

3．1 间接ELISA方法的建立

3．2 杂交瘤细胞株的建立

3．3 单抗亚类、上清及腹水效价的测定

3．4 单抗特异性鉴定结果

3．5 单抗与商品化牛MCP-1反应性的鉴定

3．6 单抗的Western blot鉴定

3．7 间接免疫荧光检测单抗与MCP-1的反应性

3．8 流式细胞术检测BoMCP-1单抗与天然抗原的反应条件

3．9 牛MCP-1单克隆抗体的初步应用

4 讨论

参考文献

致谢

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