黏附侵袭性大肠杆菌fliC、fimH基因缺失株的构建及相关功能性分析

摘要

黏附侵袭性大肠杆菌（adherent-invasive Escherichia coli，AIEC）与肠道感染的发生发展密切相关，其毒力因子影响自身在肠上皮和巨噬细胞内的存活与复制，近年来受到广泛关注的炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)可能与该致病菌密切相关。AIEC引发IBD的致病机理目前尚不明确，其鞭毛和菌毛被认为是主要的两大致病因子。AIEC菌株中基因fliC编码的鞭毛蛋白是鞭毛丝的主要结构亚基，参与细菌的一系列致病过程。Ⅰ型菌毛中fimH亚单位作为Ⅰ型菌毛的主要组成部分，在介导细菌黏附宿主细胞的同时，为进一步侵入机体创造条件。本研究以鞭毛蛋白FliC和Ⅰ型菌毛主要结构亚单位FimH为切入点，探究其在AIEC中所发挥的生物学作用，从而更好地理解AIEC的致病机理。
　　首先通过比对NCBI GenBank上不同大肠杆菌E.coli菌株的fliC、fimH基因序列，设计相应的PCR引物用于扩增检测AIEC菌株LF82(Wild-type，O83∶H1)中的fliC、fimH基因，对扩增后基因产物进行纯化、克隆以及序列测定。依据LF82的fliC、fimH基因序列设计相应的缺失引物用于Red同源重组的一步PCR法缺失靶基因。这两对缺失引物5'端分别与fliC、fimH两翼序列同源，而3'端与质粒pKD3上氯霉素抗性基因cat两翼序列同源。运用λ-Red同源重组系统，以质粒pKD3为模板，通过缺失引物扩增出含cat抗性片段的PCR产物纯化后，将该融合片段导入含有质粒pKD46的LF82菌株内，在三种Red同源重组酶的作用下，cat基因片段与靶基因发生同源重组，将fliC、fimH基因置换下来，在氨苄、氯霉素抗性平板上筛选出一次同源重组菌LF82△fliC∷cat、LF82△fimH∷cat和LF82△fliC△fimH∷cat。随后，将质粒pCP20电转导入一次重组菌内，利用其编码表达的Flp重组酶识别cat阅读框两侧Flp位点，消除氯霉素抗性基因。最后，依据PCR检测结果及测序结果分析，确认成功构建出fliC、fimH基因缺失株LF82△fliC、LF82△fimH及双缺失株LF82△fliC△fimH。并在此基础上，分别将表达fliC基因、fimH基因的pBR322质粒电化学转化入LF82△fliC、LF82△fimH中，成功构建缺失株LF82△fliC、LF82△fimH的回补株LF82△fliC/pfliC、LF82△fimH/pfimH。
　　细菌生长曲线实验结果显示各菌株生长曲线无明显差异。细菌半固体培养基运动实验结果显示缺失了fliC基因的菌株在半固体培养基上无运动性，而野生株、fimH缺失株与回补株均可观察到明显的运动环。生物被膜定量试验表明FliC与FimH均能显著影响LF82生物被膜的形成(p＜0.05)，其中fimH缺失株生物被膜形成能力下降更为明显(p＜0.01)。体外对Caco-2细胞的黏附试验结果显示fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株的黏附能力分别明显下降约74％、72％、85％(p＜0.01);体外对Caco-2细胞的侵袭试验中，fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株的侵袭能力分别下降约59％(p＜0.05)、58％(p＜0.05)、86％(p＜0.01)。随后通过Real-time PCR检测fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株主要毒力因子转录量的变化，结果显示，相对野生株LF82，fliC缺失株中Ⅰ型菌毛主要结构亚单位fimH)、P菌毛（papC）、长极性菌毛（lpf）、细胞侵袭因子（ibeA）、溶血素（hlyA）的基因转录量分别下降了43％，46％，74％，57％，94％，差异显著(p＜0.05);fimH缺失株中fliC、papC、lpf、ibeA、hlyA基因转录量分别下降了43％、52％、78％、62％、63％，差异显著(p＜0.05)。双缺失株中fliC、fimH基因基本不转录，papC、hlyA基因转录量分别下降了28％(p＞0.05)、57％(p＜0.05)，而lpf、ibeA、vat基因转录量分别上调了6％，29％，10％，差异均不显著。以上结果提示fliC和fimH基因参与LF82的生物学功能，且不同毒力因子之间发挥协同作用，共同参与致病机制。此外，黏附抑制试验结果显示LF82对Caco-2细胞的黏附作用可以被FliC多克隆抗体及D-甘露糖抑制，这提示FliC与FimH可能是其潜在的治疗靶点。小鼠肠道定植试验结果显示LF82主要定植于小鼠的盲肠和回肠部。在小鼠回肠部中，fliC、fimH单缺失株和双缺失株的定植能力较野生株相比，虽然分别下降约33％、25％、26％，但差异不显著，其潜在机制有待进一步探析。

目录

摘要

符号说明

文献综述 黏附侵袭性大肠杆菌鞭毛、菌毛结构及其致病性研究进展

1 AIEC

2 鞭毛、菌毛的结构形态及相关生物学特性

3 AIEC致病性

3．1 生物被膜形成

3．2 黏附、侵袭

3．3 免疫调节

4 其它相关毒力因子

5 小结

试验研究

研究一、LF82鞭毛亚单位基因fliC、Ⅰ型菌毛亚单位基因fimH缺失株及相应回补株的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

研究二、LF82鞭毛蛋白FliC、Ⅰ型菌毛主要亚单位FimH介导的相关功能探索

1 材料

2．方法

3．结果

4 讨论

参考文献

全文小结

论文创新点

致谢

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