沙门菌噬菌体的分离鉴定及在禽肉产品中的初步应用

摘要

近年来，病原微生物引起的食源性疾病在世界范围内频发，尤其沙门菌，作为其重要寄生宿主之一的活禽，被污染的禽类胴体与肉制品均可通过食物链使人类感染沙门菌，引起急性胃肠炎、败血症、食物中毒等疾病，对人类健康及公共卫生安全造成严重威胁。
　　抗生素是预防和治疗此类细菌感染的首选，但抗生素的长期、广泛、不合理使用，使得细菌耐药性日益加剧，导致控制此类细菌感染更加艰难，同时多重耐药在全球范围内逐渐成为治疗临床感染的威胁，寻找能有效防治病原菌感染的新方法成为研究热点。噬菌体是一种能够特异性吸附和裂解细菌的病毒，与抗生素相比，具有特异性强、指数增殖、广泛分布、研发时间短等优势，这为食源性病原菌的生物防控开辟了新的道路。
　　本研究通过大量采集样品，利用不同血清型沙门菌进行噬菌体的分离纯化，获得噬菌体。经宿主裂解谱鉴定，选择两株裂解能力强的噬菌体LP31、SP55进行生物学特性分析，主要包括宿主谱、最佳感染复数、生长曲线、pH稳定性、热稳定性、形态及遗传物质鉴定等;全基因组测序分析其遗传背景;通过摸索噬菌体的最佳应用条件，初步评估噬菌体对鸡胴体以及生物膜条件下对沙门菌的削减能力。
　　1沙门菌噬菌体的分离鉴定及初步筛选
　　从江苏省六个不同地区采集样品（污水样品和粪便样品）1100份，以肠炎沙门菌C50041、鸡白痢沙门菌C79-13、印第安纳沙门菌218作为宿主细菌进行噬菌体分离，得到325份阳性样品(29.5％)，利用双层琼脂平板法进行纯化后保存噬菌体175株。分离结果显示，不同沙门菌血清型的噬菌体分离率有差异，鸡白痢沙门菌(38.6％)略高于肠炎沙门菌(35.8％)，而印第安纳沙门菌为0;不同样品分离噬菌体时，污水样(47.2％)分离率高于粪便样(26.1％)。
　　175株噬菌体对27株包括不同血清型的沙门菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌的宿主细菌进行宿主谱初筛，噬菌体对鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌具有很好的裂解能力，阳性率达90％以上;其次伤寒沙门菌(86.9％)、德尔卑沙门菌(60％)、印第安纳沙门菌(27.4％)、甲型副伤寒沙门菌(24％);对罗森沙门菌、鸭沙门菌、火鸡沙门菌、伦敦沙门菌、布伦登芦普沙门菌、大肠杆菌以及单核细胞增生李斯特菌均不裂解，选取宿主谱较宽且裂解能力强的两株噬菌体LP31、SP55进行进一步的研究。
　　2沙门菌噬菌体的生物学特性研究及全基因组分析
　　噬菌体LP31经纯化后，噬菌斑清晰透亮，单斑直径达4mm;对鸡白痢沙门菌(59/61，97％)和肠炎沙门菌(100/104，96％)具有良好的裂解能力;最佳感染复数为0.01;对酸碱耐受范围广，在pH值4～11中可维持较好活性;在40℃～60℃的温度下可稳定存活;生长曲线表明潜伏期为10min，爆发期为90min，爆发量为23PFU/cell;噬菌体LP31属于有尾病毒目长尾病毒科，具有正多面体的头部和无收缩性的尾巴，头部直径60nm、尾长110nm。
　　噬菌体SP55单斑直径3mm;对鸡白痢沙门菌(59/61，97％)和肠炎沙门菌(97/104，93％)同样具有较强的裂解能力;最佳感染复数为0.01;在pH4～10及温度40℃～60℃的条件下下可稳定存活;生长曲线表明潜伏期为10min，爆发期为80min，爆发量为40PFU/cell;噬菌体SP55属于有尾病毒目长尾病毒科，具有正多面体的头部和无收缩性的尾巴，头部直径55nm、尾长120nm。
　　全基因组测序显示噬菌体LP31基因组大小为42600bp（GC含量50.33％），包含57个开放阅读框（ORF）、其中25个ORF已知功能或假定已知功能，剩余为假想蛋白表达序列;SP55基因组大小为42781bp（GC含量50.28％），基因组包含58个ORF，已知功能或假定已知功能有27个ORF，剩余为未知功能的假想蛋白表达序列。这些已知功能或者假定已知功能的基因分别属于噬菌体复制转录模块、噬菌体结构和组装模块、裂解宿主菌模块。通过数据库对比分析，两株噬菌体均不携带编码毒力或耐药性相关的基因，表明两株噬菌体具有实际应用潜能。
　　3沙门菌噬菌体在禽肉产品中的初步应用
　　分别对两株噬菌体应用于禽肉产品消减沙门菌（包括肠炎沙门菌和鸡白痢沙门菌）的能力进行评价。对噬菌体与宿主细菌相互作用进行了最佳条件的摸索，结合食品在常温条件下最长的储存时间确定两者的最佳互作时间为2h;对不同MOI值进行摸索以及参考沙门菌实际污染情况的相关文献，确定宿主菌与噬菌体的最佳互作浓度MOI=1000即104CFU/mL、108PFU/mL。
　　根据上述的最佳条件人工污染沙门菌，然后进行噬菌体处理，分别于4℃和25℃孵育2h。结果显示，4℃时，实验组中经噬菌体LP31、SP55处理后，鸡白痢沙门菌(2.16log CFU/mL、1.64log CFU/mL)、肠炎沙门菌(1.56log CFU/mL、1.36log CFU/mL)浓度出现不同程度的显著下降(P＜0.05);同样在25℃时，经噬菌体LP31、SP55处理后，沙门菌浓度明显降低(P＜0.05)，鸡白痢沙门菌分别减少1.52log CFU/mL、1.46log CFU/mL，肠炎沙门菌分别减少1.09log CFU/mL、0.99log CFU/mL。上述结果表明，不同温度下(4℃，25℃)两株噬菌体对鸡白痢沙门菌和肠炎沙门菌均有抑菌能力，且4℃时的抑菌效果优于25℃;五株沙门菌（3株鸡白痢沙门菌和2株肠炎沙门菌）培养24h后均形成生物膜(P＜0.05)，经过噬菌体LP31处理2h后，测定OD550nm结果表明，噬菌体LP31能够显著减少生物膜条件下的沙门菌(P＜0.05)，表现出应用于防控沙门菌生物被膜的潜力。

目录

摘要

符号说明

综述 噬菌体在食源性病原菌防控中的应用

1 噬菌体对家禽及其产品中的应用

2 噬菌体在家畜及其产品中的应用

3 噬菌体在果蔬、器皿中的应用

4 噬菌体裂解酶在食品中的应用

5 展望

研究目的及意义

第一章 沙门菌噬菌体的分离鉴定与初步筛选

1 材料

1．1 菌株

1．2 样品

1．3 主要器材

1．4 主要试剂及培养基

2 方法

2．1 宿主菌复苏

2．2 样品处理

2．3 噬菌体的分离

2．4 噬菌体的纯化

2．5 噬菌体保存

2．6 噬菌体复苏

2．7 噬菌体效价测定

2．8 宿主谱的初步筛选

3 结果

3．1 噬菌体的分离

3．2 噬菌体的纯化

3．3 噬菌体的保存

3．4 宿主谱的初步筛选

4 讨论

参考文献

第二章 沙门菌噬菌体的生物学特性研究及全基因组分析

1 材料

1．1 噬菌体及菌株

1．2 主要器材

1．3 主要试剂及培养基

2 方法

2．1 噬菌体的宿主谱筛选

2．2 噬菌体的最佳感染复数

2．3 噬菌体的生长曲线测定

2．4 噬菌体的pH稳定性

2．5 噬菌体的热稳定性

2．6 噬菌体的形态观察

2．7 噬菌体增殖与浓缩

2．8 噬菌体基因组提取及酶切

2．9 噬菌体全基因组测序

3 结果

3．1 宿主谱

3．2 最佳感染复数

3．3 生长曲线

3．4 pH稳定性

3．5 热稳定性

3．6 电镜

3．7 噬菌体基因组提取及酶切

3．8 噬菌体全基因组分析

4 讨论

参考文献

第三章 沙门菌噬菌体在禽肉产品中的初步应用

1 材料

1．1 菌株和噬菌体

1．2 主要器材

1．3 主要试剂及培养基

2 方法

2．1 宿主细菌及噬菌体的复苏

2．2 噬菌体效价测定

2．3 噬菌体和宿主菌作用的最佳时间测定

2．4 噬菌体和宿主菌作用的最佳浓度测定

2．5 噬菌体对胴体(鸡皮)沙门菌的削减能力

2．6 噬菌体对生物膜条件下沙门菌的削减能力

3 结果

3．1 噬菌体和宿主菌作用的最佳时间测定

3．2 噬菌体和宿主菌作用的最佳浓度测定

3．3 噬菌体对胴体(鸡皮)沙门菌的削减能力

3．4 噬菌体对生物膜条件下沙门菌的削减能力

4 讨论

参考文献

附录

致谢

声明