井冈霉素诱导ILP2调控褐飞虱雌虫生殖和种群变化的机制

摘要

褐飞虱（半翅目、飞虱科）是一种典型的农药诱导的再猖獗型水稻害虫。最近有研究报道井冈霉素刺激褐飞虱生殖主要与脂肪酸代谢有关。除此之外，井冈霉素刺激褐飞虱生殖是否还有其它调控途径尚不清楚。进一步分析了井冈霉素处理的褐飞虱（羽化后2d）数字基因表达谱数据，筛选出药剂诱导胰岛素信号通路中表达显著上调基因ILP2基因。然而，井冈霉素刺激褐飞虱生殖是否与胰岛素信号通路中ILP2基因表达上调有关还不清楚。本论文采用RNAi、生物测定、qRT-RCR、Western blot和免疫荧光等方法，探索ILP2调控褐飞虱生殖和种群增长的机制。主要结果如下:
　　1、井冈霉素处理后羽化2d的褐飞虱雌成虫转录组学分析
　　我们的研究利用RNA-seq测序技术，对井冈霉素处理后羽化2d的褐飞虱进行了转录组学分析，共鉴定出差异基因1165个（上调557个，下调608个）。通过本次分析共得到317条Pathways，其中与激素及其生殖调节相关的Pathways共16条，通过pathway注释与富集分析，筛选出井冈霉素处理后类胰岛素多肽基因（Insulin-like peptides2，ILP2）显著上调，采用qRT-PCR法验证井冈霉素处理对ILPs(1-4)基因表达水平的影响并进行RNAi以进一步证实该基因在营养通路中药剂刺激生殖的分子机制。为进一步研究ILP2基因的功能提供理论依据。
　　2、沉默类胰岛素多肽-2(ILP2)基因对褐飞虱生殖及其子代种群增长的影响
　　我们的研究采用dsRNA饲喂法研究褐飞虱雌虫体内ILP2基因的功能。研究结果表明ILP2基因在雌虫羽化后（1d、3d、5d和7d）表达量显著下降了约36.4％～74.6％;JGM（井冈霉素）+dsILP2处理后，褐飞虱的产卵量显著下降了约63％，产卵前期延长了约36％，产卵历期减少了约28％及子代种群数量减少57.4％和卵孵化率下降17.7％，但子代性别比没有显著影响。沉默ILP2基因表达后使羽化2d、4d和6d的雌虫卵巢不同程度上的发育延迟，同时脂肪体和卵巢内蛋白质含量也分别下降了约66％和59％及在羽化后2d和3d雌虫体内Vg表达量分别下降了约45％和37％。通过Western blot分析表明，羽化后2d的褐飞虱雌虫体内Vg表达量也显著下降。采用免疫荧光(IF)检测，发现JGM+dsILP2处理羽化后2d的雌虫体内Vg的荧光信号与JGM处理的相比信号显著减弱。脂肪体内类酵母共生菌含量与对照相比显著下降了约48％。进一步检测结果表明JGM+dsILP2处理的褐飞虱雌虫羽化后2d体内胰岛素含量显著下降了约34％，保幼激素含量下降了约19％，蜕皮激素含量增加了约30％，进一步也导致羽化2d的雌虫体重减轻，体型变小。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 药剂诱导褐飞虱再猖獗研究概况

1．1 害虫再猖獗定义

1．2 农药诱导褐飞虱再猖獗机制

2．1 胰岛素

2．2 昆虫类胰岛素多肽(ILPs)的功能

2．3 昆虫胰岛素(Insulin)信号通路

3 高通量转录组学(RNA-seq)

3．1 转录组学研究技术与方法

3．2 在昆虫中的应用领域

4 研究目的及意义

第二章 井冈霉素处理的褐飞虱转录组分析及差异基因ILP2的鉴定

2．1 供试水稻

2．2 供试虫源和药剂

2．4 转录组学分析

2．5 荧光定量

3 结果与分析

3．1 褐飞虱转录组分析

3．2 井冈霉素处理对ILPs的影响

4 讨论

第三章 沉默ILP2基因对褐飞虱生殖和种群增长的影响

1 试验材料

1．1 供试水稻

1．2 供试虫源

1．3 供试农药

2 方法

2．1 药剂处理

2．2 ds RNA的合成

2．3 dsILP2处理

2．4 实时荧光定量检测

2．5 褐飞虱雌虫产卵量、产卵前期、产卵历期和寿命测定

2．6 褐飞虱雌虫 生理生化测定

2．7 褐飞虱成虫内生殖器的解剖

2．8 免疫印迹分析(Western blot检测)

2．9 免疫荧光标记

2．10 褐飞虱种群(F1代)的数量、孵化率和雌雄比测定

2．11 数据统计分析

3 结果与分析

3．2 沉默ILP2对褐飞虱胰岛素通路下游基因表达的影响

3．3 沉默ILP2基因对褐飞虱生殖的影响

3．4 沉默ILP2对褐飞虱雌虫体内胰岛素含量的影响

3．6 沉默ILP2基因对褐飞虱雌虫体重及体型大小的影响

3．7 沉默ILP2基因对褐飞虱雌虫生殖器官的影响

3．9 沉默ILP2基因对褐飞虱雌虫脂肪体和卵巢蛋白质含量的影响

3．10 沉默ILP2对Vg在褐飞虱中表达量的影响

3．11 沉默ILP2对Vg在褐飞虱卵巢中定位及表达的影响

3．12 沉默ILP2对褐飞虱种群(F1代)的影响

4 讨论

总结

参考文献

致谢

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