鸡白痢沙门菌LPS合成和生物被膜形成相关基因缺失株的构建及免疫效力评价

摘要

鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种严重危害家禽生产的可经垂直传播的传染病。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》将其确定为优先防治病种，对种鸡群提出净化要求。在我国及其他发展中国家，常采用药物预防和控制该病，虽有一定的效果，但不能达到清除病原的目的，且长期使用抗生素会产生多重耐药性和药物残留等问题。疫苗免疫是防控该病的有效措施之一，常用疫苗为沙门菌减毒活疫苗。全血玻片凝集试验是养殖场检疫和淘汰阳性鸡的常用方法，但正常情况下无法区别自然感染动物和免疫动物(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals，DIVA)，因此研制具有DIVA特性的疫苗对种群的净化具有积极作用。
　　鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG由本实验室构建，具有致病力低、免疫原性高和DIVA等特性。生物被膜作为鸡白痢沙门菌对抗不良环境而形成的结构性细菌群落，可导致持续感染。为了进一步降低沙门菌的致病力、提高其安全性，本研究利用λ-Red同源重组技术在LPS合成相关基因缺失株的基础上，进一步构建鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因的缺失株，并对其相关生物学特性进行评价，为鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株的筛选奠定基础。
　　1.鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因缺失株的构建
　　利用λ-Red同源重组技术，在单基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG的基础上进一步缺失与生物被膜形成相关基因csgA和外膜蛋白基因ompR，通过PCR扩增及序列分析证实缺失株构建成功，分别命名为S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA△ompR和S6702△rfaG△csgA△ompR。进一步的生物学特性测定显示，单基因和双基因缺失株与野生株的生长速度无显著性差异，三基因缺失株的生长速度较其它菌株稍慢。生物被膜形成能力测定显示，缺失生物被膜形成相关基因csgA和外膜蛋白基因ompR后，双基因和三基因缺失株均无生物被膜形成能力。7种药物的药敏试验显示，野生株S6702和6株缺失株的敏感性相近，但与另一株鸡白痢沙门菌S004和肠炎沙门菌疫苗株Sm24的敏感性有一定差异。缺失株的遗传稳定性测定显示，缺失株在连续传代过程中能够稳定地遗传缺失了部分片段的各个基因，在与野生株S004混合培养过程中不能够通过自然重组获得缺失基因，具有良好的安全性。
　　2.鸡白痢沙门菌基因缺失株的致病性和免疫保护性评价
　　通过测定半数致死量(LD50)评价基因缺失株的致病性。腹腔接种2日龄SPF鸡，野生株S6702的LD50为5.5×108CFU，与其相比较，单基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG的LD50提高了至少16倍，双基因缺失株和三基因缺失株的LD50有了进一步提高。免疫保护试验中，2日龄SPF雏鸡分别口服免疫1×108CFU的缺失株和Sm24。免疫后各免疫组体重与健康对照组相比无显著差异。免疫后第14天血清的玻片凝集试验显示，缺失株免疫血清与实验室自制染色抗原和北京中海染色抗原均不产生凝集反应。利用间接ELISA检测血清中IgG抗体，免疫后第14天后IgG抗体水平较低。口服免疫14天后，腹腔注射109CFU毒力较强的鸡白痢沙门菌野生株S004，单基因缺失株能提供66.7％的保护率，双基因缺失株和三基因缺失株能够提供83.3％的保护率，Sm24肠炎疫苗株能够提供50％的保护率。通过分析攻毒后的第7天和14天体重水平，发现S6702△rfaG、S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR组的平均体重比S6702△rfaL、S6702△rfaL△csgA和S6702△rfaL△csgA△ompR的稍高，抗体水平分析结果与此一致。
　　为进一步验证S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR菌株的免疫效力，以S6702△rfaG为对照，按照上述方式免疫，免疫14天后，分别采用口服和腹腔注射的方式攻毒，腹腔注射攻毒组结果显示，S6702△rfaG、S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR组的保护率均为66.7％，差异不显著，Sm24的保护率为50％。口服攻毒组结果显示，从第3天到第5天，攻毒对照组的分离率接近100％，免疫组分离率明显下降，第5天的分离率仅有30％左右，并且各免疫组之间差异不显著。
　　综上所述，鸡白痢缺失株S6702△rfaG△csgA和S6702△rfaG△csgA△ompR具有致病力低、免疫效力高和DIVA等优势，可作为鸡白痢沙门菌减毒活疫苗的候选株。

目录

论文说明

摘要

符号说明

综述

1 沙门菌的致病机理

2 生物被膜研究进展

3 沙门菌疫苗的研究进展

4 总结

第一章 鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因缺失株的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 鸡白痢沙门菌多基因缺失株的致病性和免疫保护性评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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