用于肿瘤可视化光热/药物协同治疗的PLGA纳米诊疗剂的构建及性能研究

摘要

恶性肿瘤是当今严重威胁人类健康的最大杀手之一，因此癌症的早期诊断与高效无毒的治疗已成为目前癌症诊疗的最大挑战。光热治疗(Photothermal therapy，PTT)是近年来发展起来的一种微创肿瘤治疗技术，它利用光热转换效率高的吸光材料（光热转换试剂），在外部光源的照射下将光能转化为热能，从而实现杀伤肿瘤细胞的目的。通过光热转换试剂的肿瘤靶向传输以及对肿瘤部位选择性的照射，可极大降低全身系统毒性。理想的光热治疗剂应在近红外光区域(650-950 nm)具有较强的吸收且生物安全性高。另外，高效准确的PTT还需要依赖合适的成像技术来确定肿瘤的位置、大小、光热治疗剂在体内的分布以及在肿瘤组织的富集情况;同时要实时监测PTT过程中肿瘤及周围健康组织温度的变化并进行治疗效果的评价。因此，赋予光热治疗剂合适的成像功能，提高光热治疗的有效性及准确性已成为近年来研究的热点。为了实现这一目标，设计和制备具有诊断与光热治疗功能一体化的纳米诊疗剂(Nanotheranostics)成为最有效的解决途径之一。
　　聚乳酸—羟基乙酸共聚物(PLGA)是由两种单体——乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)随机聚合而成的高分子有机化合物，它具有良好的生物相容性、生物可降解性、机械强度以及可塑性。PLGA已通过了美国FDA的认证，正式作为药用辅料收录进美国药典。近年来有文献报道指出，通过纳米合成技术，实现对PLGA体系的结构修饰，赋予其特定功能，不仅可以作为临床分子影像探针对疾病进行诊断，而且能高效地包覆和传输药物进行疾病治疗。若能将其与肿瘤光热治疗有效地结合起来，有望提高光热治疗的有效性及准确性，大大缩短疾病的诊治时间，实现肿瘤高效准确的一体化诊疗，减少患者的痛苦和医疗成本。本论文详细研究了两种可用于肿瘤可视化光热/药物协同治疗的PLGA纳米诊疗剂，并对其进行了结构和性能上的有效评价。
　　目的:
　　纳米药物传递载体在提高肿瘤治疗上有着多种效能，同时，成像引导的诊断和治疗在纳米药物领域也已被广泛应用，但是，将上述性能高效地整合为一体仍是纳米医学领域中的一大挑战。因此，本论文构建了一种锰离子连接的载阿霉素(DOX)聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒，锰离子在PLGA的表面的螯合赋予了其核磁成像的功能，DOX的负载及光热转换剂的引入赋予了其肿瘤化疗-光热协同治疗的效果。其次，在载阿霉素PLGA纳米粒表面修饰上金(Au)颗粒，使其同时具备了药物负载、过氧化氢模拟酶活性、光声(PA)成像能力和光热转换性能，进一步构建高效准确的纳米诊疗系统。
　　方法:
　　第一章 Mn2+-PDA@DOX/PLGA纳米诊疗剂用于肿瘤化疗/光热协同治疗
　　本章通过复乳溶剂挥发法制备载DOX的PLGA(DOX/PLGA)纳米粒，然后通过多巴胺的自聚反应在其表面修饰上聚多巴胺(PDA)，形成PDA@DOX/PLGA纳米粒。接着，在PDA@DOX/PLGA的表面连接上Mn2+形成Mn2+-PDA@DOX/PLGA纳米粒。采用多种检测手段分析该纳米诊疗剂的物理化学特性，主要包括尺寸分布、结构特点、磁学性能、载药及释放性能等。构建小鼠结肠癌肿瘤细胞(CT26)小鼠皮下移植瘤模型，探讨体内外核磁成像效果，并对其生物应用安全性进行检测:主要包括细胞毒性试验，肿瘤细胞对诊疗剂的摄取实验，生物相容性及体内分布，同时考察诊疗剂协同药物与光热剂对荷瘤小鼠的治疗效果，并进行预后检测。
　　第二章 Au-PLGA复合纳米诊疗剂的构建及光声成像引导下的肿瘤光热/化疗协同治疗
　　在前期实验的基础上，本章制备了PLGA/DOX@PDA纳米粒，随后将HAuCl4·3H2O滴加至PLGA/DOX@PDA纳米悬液，PDA层中的活性基团可将AuCl4-还原成金纳米颗粒，得到PLGA/DOX@PDA-Au纳米粒。最后，将PLGA/DOX@PDA-Au纳米粒悬液与PEG-NH2水溶液混合，获得PEG修饰的PLGA/DOX@PDA-Au纳米粒（PLGA/DOX@PDA-Au-PEG）。同样采用多种检测方法对纳米粒的理化性质进行表征，探讨其形态及结构特征和体外各项性能进行考察，包括:体外稳定性、体外光声成像、生物相容性及光热性能、过氧化物酶活性、DOX的释放以及细胞对纳米粒的摄取能力等。最后，构建小鼠乳腺癌细胞(4T1)皮下移植瘤模型，进行体内效果评价，考察PLGA/DOX@PDA-Au诊疗剂在体内的分布、PA成像、协同抗癌活性及体内生物相容性等。
　　结果与结论:
　　第一章:本章所制得的Mn2+-PDA@DOX/PLGA纳米粒呈球形，粒径约为200 nm，尺寸均一。同时，Mn2+成功连接于PDA@DOX/PLGA的表面赋予了纳米颗粒核磁共振成像的能力。Mn2+配位连接方式实现了温度及pH敏感响应性核磁成像效果。通过将光能转化为热能，Mn2+-PDA@DOX/PLGA纳米粒能够在小鼠模型中直接杀死肿瘤，热敏感的DOX释放模式有助于提升化疗药物的肿瘤治疗效果。该Mn2+-PDA@DOX/PLGA纳米粒可用于核磁成像引导下的肿瘤化疗/光热协同治疗。
　　第二章:本章制备的Au-PLGA复合纳米粒呈球形，粒径约为200 nm，Au纳米颗粒均匀分布在纳米粒表面，PEG的修饰连接极大地提高了纳米粒的水溶性和稳定性。实验结果显示，该复合纳米粒拥有高达69％的光热转换效率，同时，产生的强烈超声信号还赋予了其在肿瘤诊断中良好的PA成像性能。在808 nm激光照射下，O2的产生、DOX的释放和活性氧(ROS)的水平均明显提高，而这些都有助于缓解肿瘤缺氧并增强化疗/光热联合癌症治疗效果。该功能化的Au-PLGA复合纳米粒能够用于PA成像引导下的疾病诊断和协同肿瘤消融。

目录

摘要

符号说明

文献综述 近红外光介导的PLGA纳米诊疗剂研究新进展

第一章 Mn2+-PDA@DOX／PLGA纳米诊疗剂用于肿瘤化疗／光热协同治疗

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 仪器

2．方法

2．2 Mn2+-PDA@DOX／PLGA纳米诊疗剂的体外性能研究

2．3 Mn2+-PDA@DOX／PLGA纳米诊疗剂的体内性能研究

3．结果

3．1 Mn2+-PDA@DOX／PLGA纳米诊疗剂的构建及表征

3．2 Mn2+-PDA@DOX／PLGA纳米诊疗剂的体外性能研究

3．3 Mn2+-PDA@DOX／PLGA纳米诊疗剂的体内性能研究

4．小结

参考文献

第二章 Au-PLGA复合纳米诊疗剂的构建及光声成像引导下的肿瘤光热／化疗协同治疗

1．材料与仪器

1．1 材料

1．2 仪器

2．方法

2．3 PLGA／DOX@PDA-Au纳米诊疗剂的体内性能研究

3．结果

3．1 PLGA／DOX@PDA-Au纳米诊疗剂的构建及表征

3．2 PLGA／DOX@PDA-Au纳米诊疗剂的体外性能研究

3．3 PLGA／DOX@PDA-Au纳米诊疗剂的体内性能研究

4．总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的学术成果

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