重组鼠磷脂酶D2腺病毒的构建及其功能的初步研究

摘要

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)的鼠磷脂酶D2野生型及其功能缺陷型的重组腺病毒颗粒；初步研究在产单核细胞李斯特菌刺激下细胞内PLD活性变化。 方法:将mPLD2基因及其功能缺陷点突变基因mPLD2(K758R)从真核表达载体pCGN中分别克隆至带有GFP的穿梭载体中；再与腺病毒骨架载体一起在E.coliBJ5183中进行同源重组，构建含GFP的mPLD2及其功能缺陷型的重组腺病毒表达质粒；重组腺病毒质粒用脂质体转染入293细胞中进行包装，产生重组mPLD2(野生型及其功能缺陷型)腺病毒颗粒；用该重组腺病毒感染293细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光产生的情况，同时免疫印迹确证mPLD2蛋白在细胞内的表达。　　用重组腺病毒(野生型及其功能缺陷型)分别感染vero细胞，同时用空白腺病毒感染vero细胞作为对照，测定李斯特菌刺激后胞内PLD活性变化。 结果:获得高滴度重组mPLD2腺病毒颗粒(野生型及其功能缺陷型)，病毒颗粒可有效感染293细胞，荧光显微镜下监测到大量发绿色荧光的细胞；抗体免疫印迹显示，mPLD2蛋白在293细胞中有大量表达。　　mPLD2蛋白、mPLD2(K758R)蛋白的过度表达对vero细胞内PLD基础活性无影响；而用李斯特菌刺激后vero细胞内PLD活性较其基础活性均有明显的增强(p＜0.001)；在李斯特菌刺激组中，mPLD2蛋白的过度表达与感染空白腺病毒的对照相比使细胞内PLD活性增强约45％(p＜0.01)，mPLD2(K758R)蛋白的过度表达使其活性降低约40％(p＜0.01)。 结论:成功构建了含GFP的mPLD2的重组腺病毒颗粒(野生型及其功能缺陷型)，并初步研究证明李斯特菌刺激的vero细胞伴随胞内PLD的激活，为进一步研究PLD在李斯特菌侵染细胞过程中的功能及其激活机制提供了高效的技术平台。

目录

文摘

英文文摘

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引 言

第一部分重组鼠磷脂酶D2腺病毒的构建及表达

材料与方法

结果

讨论

第二部分李斯特菌诱导的非吞噬细胞内PLD2活性变化的初步研究

材料与方法

结果

讨论

小 结

参考文献

攻读学位期间本人公开发表的论文

PLD与李斯特菌诱导的细胞骨架重排

致 谢