三氧化二砷治疗动物肺纤维化的深入研究

摘要

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种病因不明的、慢性、弥漫性、进行性肺间质疾病，以普通型间质性肺炎(UIP)为特征性病理改变。目前特发性肺纤维化的治疗以激素和激素联合免疫抑制剂为主，但是临床疗效不佳。三氧化二砷在临床上已被成功应用于急性早幼粒细胞性白血病(APL)的治疗，因其疗效显著且毒副作用小等优点，已有学者将其用于其他疾病治疗的研究报道，如在呼吸系统疾病中，已经发现三氧化二砷可以通过诱导嗜酸性粒细胞凋亡而控制实验动物的哮喘发作。那么三氧化二砷是否也能诱导肺内相关细胞(如炎性细胞和/或成纤维细胞)的凋亡，减少肺泡炎症反应和继之发生的肺纤维化以及成纤维细胞灶的形成，从而用于特发性肺纤维化的治疗？或者与糖皮质激素联合应用，从而减少皮质激素的用量？本实验从三氧化二砷诱导细胞凋亡的角度研究其治疗动物肺纤维化的机理，并观察比较了单用三氧化二砷及其与地塞米松联合应用的疗效，为日后临床应用提供依据。 第一部分：地塞米松治疗动物肺纤维化最佳剂量探索 目的：观察不同剂量的地塞米松(DXM)对博莱霉素致大鼠肺纤维化的治疗作用及其副作用，探索DXM治疗动物肺纤维化的有效安全剂量，为正式实验时DXM剂量的选择提供实验依据。 方法：将144只雄性SD大鼠随机分为4大组：(1)对照组(n=18)：气管内单次注射生理盐水，次日起每日腹腔注射生理盐水(2) DXM副作用观察组(n=54)：气管内单次注射生理盐水，次日起每日腹腔注射DXM，并与对照组比较，以观察DXM的副作用(3)模型组(n=18)：气管内单次注射博莱霉素( Smg/kg)制作大鼠肺纤维化模型，次日起每日腹腔注射生理盐水(4) DXM疗效观察组(n=54)：气管内单次注射博莱霉素(5mg/kg)制作大鼠肺纤维化模型，次日起每日腹腔注射DXM，并与模型组比较，以观察DXM的疗效。再根据DXM剂量的不同将DXM副作用观察组和DXM疗效观察组各分为1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg三个亚组；最后根据不同的观察时间将各亚组分为观察14天、28天、56天三个小组。观察指标：(1)大鼠一般情况(2)大鼠存活情况(3)大鼠肺组织病理学观察(4)大鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量测定(5)大鼠肝、肾组织病理学观察。 结果：(1)模型组、DXM副作用观察组、DXM疗效观察组大鼠的一般情况均较对照组差，体重较对照组明显降低，且DXM副作用观察组、DXM疗效观察组大鼠体重下降更明显。(2) DXM副作用观察3mg/kg组的56天死亡率与相应对照组及DXM副作用观察Img/kg组比较差异有统计学意义(P<0.05)；DXM疗效观察3mg/kg组的56天死亡率与相应对照组、模型组、DXM疗效观察1mg/kg组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3) DXM在一定程度上能减轻博莱霉素致肺纤维化大鼠的肺泡炎和纤维化程度，但随其剂量的增加和用药时间的延长，其致肺部炎症的机率也增加，而对纤维化的改善作用变化不明显。(4)绝大多数DXM疗效观察组HYP含量均较相应模型组为低，差异有统计学意义(P<0.05)，三个剂量的DXM疗效观察组间差异无统计学意义(P>0.05)。(5) DXM副作用观察组和DXM疗效观察组大鼠肝组织普遍存在脂肪变性，而其肾组织可见肾小管内炎性细胞浸润。 结论：1mg/kg的DXM既能改善大鼠肺纤维化又未致大鼠严重感染和死亡率的增加，是治疗大鼠肺纤维化的有效安全剂量，拟于正式实验采用此剂量。 第二部分：三氧化二砷对博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织细胞凋亡的影响 目的：观察三氧化二砷( ATO)及三氧化二砷联合地塞米松(DXM)对博莱霉素致肺纤维化大鼠的治疗作用，并从诱导细胞凋亡的角度探讨其治疗机理。 方法：将240只SD大鼠随机分为5组，每组48只：对照组(气管内单次注射生理盐水+每日腹腔注射生理盐水)、模型组(气管内单次注射博莱霉素5mg/kg造模+每日腹腔注射生理盐水)、ATO治疗组(气管内单次注射博莱霉素5mg/kg造模+每日腹腔注射AT00.6mg/kg)、DXM治疗组(气管内单次注射博莱霉素5mg/kg造模+每日腹腔注射DXM1mg/kg)、ATO+DXM治疗组(气管内单次注射博莱霉素5mg/kg造模，每日腹腔注射ATO0.3mg/kg+DXM0.5mg/kg)；再根据造模后不同的给药时间点将各组分为T1(造模后14天给药组)和T2(造模后28天给药组)两个亚组，每组24只；最后再将每个亚组根据给药时间的长短分为14天、28天、56天三个小组，每组8只。观察指标：(1)肺组织病理HE染色观察肺泡炎和纤维化情况并评分(2)肺组织HYP含量测定(3)透射电镜观察肺组织超微结构变化(4)凋亡相关基因P53、C-myc、Bax、Bcl-2的表达情况。 结果：(1)肺组织肺泡炎和纤维化程度分级及评分：对照组病理评分肺组织肺泡炎和纤维化程度分级均较其余各实验组低，差异有统计学意义(P＜0.05)；除造模后28天开始干预的地塞米松28天组、56天组外，其余各药物干预组病理评分均较相应模型组低，但仅有造模后14天开始干预的三氧化二砷各组、联合干预各组以及地塞米松14天组有统计学意义。(2) HYP含量测定：对照组HYP含量在各时间点均低于其余各实验组，差异有统计学意义(P＜0.05)。除造模后28天开始干预的地塞米松28天、56天组和造模后28天开始干预的联合干预28天、56天组以外，其余各干预组HYP含量均较相应的模型组下降，但差异有统计学意义(P＜0.05)的仅局限于造模后14天开始干预的部分小组。在某些时间点，三氧化二砷组的HYP含量与相应地塞米松组和联合干预组相比有明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)透射电镜观察：三氧化二砷组大鼠肺组织胶原纤维沉积比模型组明显减少，并可见大量凋亡的炎性细胞。(4)凋亡相关基因的表达：所有药物干预组的P53和C-myc表达量均显著高于相应模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)；大部分药物干预组的Bax表达量均显著高于相应模型组(P＜0.05)，大部分药物干预组的Bcl-2表达量显著低于相应模型组(P＜0.05)，大部分地塞米松组的Bcl-2表达量显著高于相应模型组(P＜0.05)。 结论：适当剂量的三氧化二砷能减少博莱霉素致肺纤维化大鼠的肺部胶原纤维沉积，且致感染率显著低于地塞米松，早期应用疗效更佳。其治疗机理可能与三氧化二砷诱导肺组织内以炎性细胞为主的细胞群的凋亡有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一部分 地塞米松治疗动物肺纤维化最佳剂量探索

引 言

材料和方法

一、实验动物

二、动物分组、处理方法及观察指标

结 果

小 结

第二部分 三氧化二砷对博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织细胞凋亡的影响

引 言

材料和方法

一、实验动物

二、动物分组、处理方法及观察指标

结 果

1.大鼠肺组织病理切片HE染色观察及评分

2.大鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量测定

3.大鼠肺组织透射电镜下超微结构观察

4.大鼠肺组织凋亡相关基因P53、C-mye、Bax、Bcl-2的表达情况

讨 论

结 论

参考文献

综述：细胞凋亡与特发性肺纤维化的关系研究进展及三氧化二砷的临床应用展望

实验试剂和仪器

攻读学位期间公开发表的论文

致 谢