可溶性CD80分子免疫放射分析方法的建立及应用研究

摘要

目的：建立可溶性共刺激分子CD80的免疫放射分析方法(IRMA)，探讨其临床应用。 方法：①采用Iodogen法进行抗CD80单抗10D9的125I标记，分别改变Iodogen的用量、抗体的用量、125I的活度及反应时间，摸索在不同条件下标记的效果，寻找一最佳标记条件；标记产物用SephadexG-50分离纯化，三氯醋酸(TCA)法测定其标记率和放化纯：将125I-10D9与不同细胞数的人B细胞淋巴瘤Daudi细胞悬液在37℃细胞培养箱中反应，测定标记物的免疫活性；将标记物分别加入到生理盐水、血清及0.05MpH7.4的PBS液(含1％BSA)中，另取标记物不稀释作为对照，分别置于37℃及4℃条件下，观察放置3d、1w、2w、3w、4w、6w后标记物的稳定性。②采用物理吸附法制备单克隆抗体4E5的固相包被管，用不同浓度的抗体、不同pH的缓冲液包被试管，并选择适宜的反应温度及时间、最佳封闭时间等，以确定最佳包被条件；将制备好的固相抗体分别放置于37℃及4℃条件下，储存1w、2w、4w、6w、8w后，测定其与抗原的免疫结合，观察其稳定性。③建立双位点夹心可溶性CD80分子的IRMA，检测各类自身免疫性疾病及肿瘤患者血清中的CD80含量并与正常对照组比较。 结果：①125I标记10D9的最佳条件为：Iodogen用量10μg、10D9用量20μg、加入Na125I22.2MBq、室温反应8min，125I-10D9的标记率和放化纯达到最佳水平，标记率为(84.10±3.18)％，放化纯为(98.49±1.14)％，比活度为933.51MBq/mg；125I-10D9与Daudi细胞的结合率随细胞数的增加而增加，当细胞数为1×107时结合率达到最高水平，此时总细胞结合率为(25.77±1.07)％，特异性细胞结合率为(23.15±1.07)％；标记物加入到不同稀释液中后，在4℃条件下，对照组及人血清组1w后、PBS组3w后放化纯度仍大于90％；在37℃条件下，对照组3d后、人血清组1w后、PBS组2w后放化纯度仍大于90％；而生理盐水组放置3d后放化纯即明显下降(P<0.01)。②4E5固相包被管制备的最佳条件为：用0.05MpH7.4的磷酸盐缓冲液稀释抗体4E5至8.0mg/L，室温反应24h:包被好的试管用2％的BSA封闭，封闭时间6～8h为佳；包被管在4℃条件下放置8w仍保持很好的稳定性。③建立的可溶性CD80分子IRMA，其灵敏度为0.14μg/L，批内变异系数为6.46％～7.87％，批间变异系数为7.89％～9.27％，回收率为86.64～104.05％；该方法检测的各类标本结果显示，类风湿性关节炎、甲亢、桥本氏病、慢性肾炎、糖尿病及B细胞淋巴瘤患者血清中的CD80含量明显高于正常对照组(P＜0.01)，而恶性肿瘤患者血清中的CD80含量明显低于正常对照组(P＜0.01)。 结论：本研究建立的可溶性CD80分子的免疫放射分析法，操作简便，方法学稳定，有重要的临床应用价值。

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论文说明:缩写词表

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研究背景

第一部分：建立稳定的125Ⅰ 标记单克隆抗体10D9的方法

1.材料和方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第二部分：可溶性CD80分子免疫放射分析方法的建立及临床应用

1.材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

小 结

B7-CD28家族分子的免疫调节功能及临床应用

攻读学位期间公开发表的论文

致谢