线粒体损伤在α粒子致细胞恶性转化中的作用

摘要

目的：探讨并验证线粒体功能改变和线粒体DNA突变在α粒子致细胞恶性转化中的作用机制。
　　 方法：⑴建立α粒子体外照射致人小气道上皮细胞 (Small airway epithelial cells，SAEC)恶性转化的模型。不同剂量(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0Gy)α粒子分单次和多次照射SAEC细胞，平板克隆形成试验检测不同剂量α粒子对SAEC细胞的存活分数影响。细胞照射后常规培养于37℃，5[％] CO2培养箱中，定期检测细胞对血清和PALA的抵抗性以及细胞的增殖活性。同时检测细胞在软琼脂中的锚着独立生长能力，Transwell小室观察细胞的侵袭特性，Western blot法测定癌基因c-myc和抑癌基因p53的蛋白表达。选择具有恶性转化特性的细胞接种裸鼠，观察裸鼠体内的成瘤情况。⑵检测恶性转化细胞中线粒体功能与线粒体DNA的突变情况。以12S rRNA扩增线粒体DNA，18S rRNA(GAPDH)扩增核DNA，Real-time PCR检测细胞的线粒体DNA相对拷贝数。采用巢式PCR联合Real-time PCR检测细胞线粒体的Common deletion缺失率。生化试剂盒和Western blot检测细胞线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase，COX)活性和蛋白的表达。JC-1荧光探针流式细胞仪检测细胞的线粒体膜电位。氧电极法检测细胞的氧耗量情况。以软琼脂克隆形成率、c-myc为自变量，SPSS17.0软件分析线粒体拷贝数、common deletion缺失率、COX活性、膜电位、氧耗量与细胞恶性转化程度的相关性。⑶通过大鼠吸入试验验证细胞的体外染毒结果。Wistar大鼠置于多功能生态氡室慢性吸入染毒，累积染毒剂量分别达100、200、400工作水平月(Working level month，WLM)，组织病理学HE染色和masson胶原纤维染色观察氡致大鼠肺组织的病理学改变。分离大鼠肺组织线粒体，生化试剂盒测定线粒体COX活性，并与病理学改变作相关分析。
　　 结果：①细胞存活分数显示随α粒子照射剂量增大细胞存活分数逐渐降低，呈剂量-效应关系。照射后培养过程中，细胞逐渐出现转化特性，血清抗性和PALA抗性以及细胞增殖活性显著增加，出现生长接触抑制。首次照射后4个月，照射组细胞具备明显的锚着独立生长能力，可形成软琼脂克隆，其中0.8Gy组克隆形成率最高，形成的克隆也最大。侵袭试验显示照射组细胞侵袭能力明显增强，同时癌基因c-myc蛋白表达明显升高，而野生型抑癌蛋白p53减少或消失，表明照射组细胞已发生恶性转化。裸鼠接种试验，细胞接种后4个月，0.8Gy多次照射组5只裸鼠有3只在接种部位出现结节，组织病理鉴定为上皮源性肿瘤。②Real-time PCR结果显示各转化组细胞线粒体拷贝数增加1.4-2.9倍，common deletion缺失率升高2.6-4.9倍。线粒体功能检测显示COX的整体活性下降，COX1和COX4的蛋白表达均降低，线粒体膜电位下降，细胞氧耗量降低。相关性分析显示线粒体拷贝数、common deletion缺失率、COX活性与软琼脂克隆形成率和c-myc表达之间呈有统计学意义的相关。③大鼠肺组织病理结果，与正常对照组相比，可见氡染毒组肺间质充血水肿，肺泡间隔增厚，炎症细胞浸润，包括中性粒细胞，淋巴细胞与巨噬细胞等，肺组织逐渐发生纤维化，肺泡腔逐渐萎缩变小。软件分析结果显示肺泡间隔厚度逐渐增加，平均肺泡腔面积逐渐减少，COX活性测定结果显示其活性随着氡染毒剂量的增加逐渐降低。相关性分析显示肺泡隔厚度与COX活性呈负相关，而肺泡腔面积与COX活性呈正相关。
　　 结论：⑴α粒子体外照射可使人SAEC细胞发生恶性转化并在裸鼠体内成瘤。⑵α粒子照射后的细胞在恶性转化过程中，出现了一系列线粒体功能和线粒体DNA的改变。这些改变与细胞的恶性转化程度呈相关关系，提示在辐射致癌机制中线粒体损伤也是一条可能的效应途径。⑶在氡染毒大鼠中，观察到线粒体细胞色素C氧化酶活性与肺组织的病理改变程度相关，在动物整体水平上初步验证了氡致肺癌过程中，线粒体损伤可能起着重要的作用。