结核分枝杆菌无毒株H37Ra启动子突变基因的比较分析

摘要

目的：通过分析结核分枝杆菌无毒株H37Ra的全基因组序列,并与H37Rv基因组序列比较,发现一些基因的启动子区域发生了突变,我们利用分枝杆菌启动子探针载体pMC210,分别构建了结核分枝杆菌H37Ra和H37Rv的六个重要基因(sec、pabB、phoH2、sigC、nrdH、lpdA)的启动子探针重组载体。利用报告基因lacZ检测突变前后启动子的活性变化。同时,确认启动子突变与其基因转录水平的关系,探索结核分枝杆菌H37Ra毒力丧失的内在因为。
　　 方法：利用生物信息学方法预测这六对基因(sec、pabB、phoH2、sigC、nrdH、lpdA)的启动子区域,采用PCR技术克隆这六对基因的启动子,双酶切后与分枝杆菌启动子探针载体pMC210对应的双酶切片段相连,DNA测序证实连接片段正确后,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中。通过体外测定β-半乳糖苷酶的活性来评估启动子的强度和Quantitative Real-Time RT-PCR的方法检测报告基因lacZ的转录水平差异,检测启动子的突变对相应基因转录水平的影响。
　　 结果：通过PCR和构建克隆测序比对发现基因sec、phoH2、sigC、nrdH的启动子与GenBank上提交的序列存在差异,结核分枝杆菌无毒株H37Ra和有毒株H37Rv相比较,基因sec、phoH2、sigC、nrdH预测的启动子并没有突变。只有基因pabB和lpdA存在启动子突变。H37Rv和H37Ra的pabB基因的启动子探针重组载体转化耻垢分枝杆菌后,体外测定的β-半乳糖苷酶的活性较弱,无统计学意义,而Quantitative Real Time PCR检测结果显示H37Ra pabB启动子调节报告基因lacZ转录的活性是H37Rv pabB启动子的6倍(p<0.05),H37Rv和H37Ra lpdA启动子探针重组载体体外测得的β-半乳糖苷酶的活性和Real time PCR结果均显示H37Rv lpdA启动子调节报告基因lacZ表达的活性比H37Ra lpdA启动子高2倍(p<0.05)左右。
　　 结论：pabB,lpdA的启动子在H37Ra中的突变对其启动子活性的产生了显著的影响,并且lpdA启动子突变可能与结核分枝杆菌H37Ra的毒力丧失有关。