烟曲霉诱导宿主细胞吞噬过程中磷脂酶D的激活及其功能研究

摘要

目的：本研究探讨烟曲霉分生孢子在侵染人肺Ⅱ型上皮细胞(A549)过程中宿主细胞内重要的信号效应蛋白磷脂酶D(PLD)活性变化及其对烟曲霉侵染率的影响,并初步分析该内化吞噬的过程中烟曲霉分生孢子、肌动蛋白骨架以及PLD活性的相互关系。
　　 方法：以烟曲霉分生孢子刺激人肺Ⅱ型上皮细胞(A549)作为模型,分别采用脂化学法及Triton破膜法测定不同感染比(MOI,真菌孢子/细胞)和不同感染时间下,细胞内PLD活性以及烟曲霉分生孢子侵染率的变化；采用脂化学法分别测定烟曲霉活菌和热灭活菌的休眠孢子、膨胀孢子、出芽孢子刺激A549细胞后引起的细胞内PLD活性变化；利用免疫荧光标记以及激光共聚焦显微镜等技术,观察烟曲霉分生孢子在侵染A549细胞过程中与细胞肌动蛋白骨架和PLD蛋白的关系；用不同浓度的PLD蛋白化学抑制剂(1-丁醇)预处理细胞,测定其对烟曲霉分生孢子侵染率的影响；分别通过短暂转染技术和RNA干涉技术造成细胞内PLD基因表达的上调和下调来研究其对烟曲霉分生孢子侵染率的影响。
　　 结果：烟曲霉分生孢子对A549细胞的侵染率随感染比(MOI)和感染时间的增加而显著增加,同时均伴有细胞内PLD的显著激活(p<0.05)；烟曲霉活菌的休眠孢子、膨胀孢子和出芽孢子均可以激活细胞内PLD(p<0.05),其中膨胀孢子的激活作用最为明显。分生孢子经热灭活后激活细胞内PLD作用不如活菌明显；烟曲霉分生孢子刺激.A549细胞后肌动蛋白骨架发生剧烈重排,并在烟曲霉分生孢子周围形成了吞噬泡,同时细胞被孢子刺激后其PLD蛋白移位至吞噬泡周围与孢子产生明显的共定位；用一定浓度(0.4％)的PLD化学抑制剂1-丁醇预处理A549细胞可显著降低烟曲霉分生孢子对细胞的侵染率(p<0.05)；细胞内PLD基因表达上调或下调后烟曲霉侵染率均有明显下降(p<0.05)。
　　 结论：烟曲霉分生孢子侵染A549细胞过程中伴有PLD的激活和细胞肌动蛋白骨架的重排,二者与烟曲霉分生孢子在空间上的定位密切相关；细胞内PLD活性变化对于烟曲霉内化侵入具有明显的抑制作用,PLD表达上调或下调均不利于烟曲霉的内化侵入。细胞内PLD激活与烟曲霉内化过程的关系仍有待于进一步研究。