人恶性胸水来源树突状细胞PD-L1的表达及其对恶性胸水中T细胞功能的调节作用

摘要

树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内最强的抗原提呈细胞（antigen presentingcell，APC），能够刺激初始T细胞活化，它可通过诱导产生CD8+细胞毒性T细胞（CTL）直接或间接杀伤肿瘤细胞来实现抗肿瘤的作用。程序性死亡配体-1（Programmed deathligand-1，PD-L1）是B7/CD28协同刺激因子超家族的重要成员，PD-L1与其受体PD-1（programmed death-1）相互作用可抑制T细胞的活化增殖和细胞因子的分泌，负调控免疫应答，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。本实验目的在于检测恶性胸水来源的DC上PD-L1的表达，从而研究DC与PD-L1对肺癌局部微环境胸水中T细胞的生物学功能的调节作用，初步探讨PD-1/PD-L1途径在肺癌免疫逃逸中的作用。
　　 第一部分结核性和恶性胸水中淋巴细胞亚群比例变化。
　　 目的：比较结核性和恶性胸水中淋巴细胞亚群比例及IFN-γ/含量。
　　 方法：结核性胸膜炎患者16例和恶性胸水患者22例，在治疗前采集胸水标本，离心收集细胞悬液，有核细胞计数、分类、流式细胞仪检测淋巴细胞亚群，检测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比例，并计算CD4+T/CD8+T比值，ELISA法检测胸水上清液中干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）含量。
　　 结果：结核性胸水中T辅助淋巴细胞以CD4+T细胞为主，其CD3+、CD4+T细胞比例（P<0.01）以及CD4+T/CD8+T比值（P<0.05）均高于恶性胸水组。两组研究对象IFN-γ的浓度分别是：结核性胸水组1140.16±266.82pg/ml；恶性胸水组31.49±22.36pg/ml。结核性胸水IFN-γ水平明显高于恶性胸水（P<0.01）。
　　 结论：结核性胸水表现为Th1免疫应答为主；而恶性胸水存在明显的细胞免疫功能低下。IFN-γ可作为鉴别结核性胸水和恶性胸水的指标之一。
　　 第二部分恶性胸水来源树突状细胞的诱导及其表面PD-L1的表达。
　　 目的：研究恶性胸水来源DC表面PD-L1的表达。
　　 方法：双层Ficoll密度梯度离心法获得胸水单个核细胞，CD14阳选磁珠分选出DC前体细胞，即单核巨噬细胞，在单核巨噬细胞中加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白细胞介素4（Interleukin-4，IL-4）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）进行体外培养。应用光镜观察细胞形态；用流式细胞仪对DC进行表型鉴定。同种方法培养外周血单个核细胞。
　　 结果：肺癌恶性胸水中的单个核细胞经CD14阳性磁珠分离选择，获取CD14+细胞，经流式细胞仪检测细胞纯度在90％以上。体外经GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导，可培养为成熟DC。所获DC显示其特有的毛刺状突起，高表达CD80（90.3±5.7％）、CD83（73.8±6.9％）、HLA-DR（94.4±2.8％），中度表达CD1α[（31.5±6.0％），且高度表达PD-L1（92.9±4.3％），与正常人外周血来源的DC相比，差异无统计学意义（P>0.05）。
　　 结论：恶性胸水中的前体细胞体外培养可获得具备正常形态、表型的成熟DC，体外培养成熟的DC高表达PD-L1。
　　 第三部分树突状细胞表面：PD-L1分子对恶性胸水中T细胞生物学功能的调节作用。
　　 目的：探讨高表达PD-L1的DC对肺癌恶性胸水T细胞生物学功能的调节作用。
　　 方法：收集培养成熟的DC、复苏冻存的胸水T淋巴细胞，将DC和T细胞按1：10的比例混合反应，设实验组：T+PHA组、T+PHA+DC组、T+PHA+DC+PD-L1MAb组及T细胞组。共培养3天，MTT法检测T细胞的增殖效应，ELISA法检测T细胞分泌IFN-γ的水平，流式细胞术分析T细胞表型。
　　 结果：刺激细胞/效应细胞按1：10的比例混合反应，与T+PHA组比，T+PHA+DC组的T细胞增殖明显[（0.191±0.078）vs（0.372±0.065），P<0.01]，IFN-γ的分泌水平增高[（135.45±9.47）pg/ml vs（342.16±42.74）pg/ml，P<0.01]。T+PHA+DC组与T+PHA+DC+PD-L1MAb组相比，T+PHA+DC+PD-L1MAb组T细胞增殖显著[（0.372±0.065）vs（0.536±0.144），P<0.05]，IFN-γ的分泌水平更高[（342.16±42.74）pg/ml vs（507.56±57.89）pg/ml，P<0.05]。各实验组CD25的表达无明显差异。T+PHA+DC+PD-L1MAb组与T+PHA组比较，CD69增高16％（P<0.05），与T+PHA+DC组相比无差异。
　　 结论：高表达PD-L1的DC可刺激T细胞的增殖与活化，当封闭PD-L1分子后，DC刺激T细胞的功能增强。进一步证明PD-1/PD-L1途径对肺癌恶性胸水中T细胞的功能具有负性调节作用。