双调控溶瘤腺病毒携带超抗原SEA基因治疗前列腺癌基础研究

摘要

目的：构建表达超抗原SEA基因的由前列腺特异性抗原（PSA）启动子及端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA。体外实验观察SEA基因的表达及其刺激淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能，及SEA 促细胞因子分泌作用。
　　 方法：从前列腺癌组织基因组DNA中获得522bp大小的PSA 启动子序列，将PSA启动子克隆到由hTERT 启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体SG502中，得到靶向前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体SG504。将已构建好的含有771bp大小SEA基因片段的病毒骨架质粒PPE3-ccdb-SEA 与SG504 用Lipofectamine2000 共转染至293细胞。共转染后9～14d 出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，经鉴定正确的腺病毒命名为SG504-SEA,即携带SEA基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒。通过RT-PCR 检测SEA 在前列腺癌DU145 细胞内不同时间段mRNA表达，分别于12、24、48h 提取细胞总RNA 行RT-PCR 检测SEA 在核酸水平的表达量；将重组病毒以5MOI的滴度感染肿瘤细胞DU145，分别于12、24、48h 取出，免疫荧光定位SEA表达于前列腺癌细胞；western blot测定SEA蛋白表达；显微镜下动态观测淋巴细胞与前列腺癌细胞共培养，ELISA 检测TNF和IL-2分泌。
　　 结果：经PCR及酶切鉴定，SEA基因成功克隆到病毒载体中，可以表达SEA基因，且病毒滴度为2.0×1010pfu/ml。RT-PCR 检测SG504-SEA 在肿瘤细胞内不同时段mRNA的表达，琼脂糖电泳252bp 处可见清晰条带，转染前列腺癌DU145 细胞在12、24、48小时持续表达SEA mRNA；免疫荧光定位DU145 细胞表面可以看到明显的荧光表达,可以确定SEA基因表达于前列腺肿瘤的细胞膜上,并且不同时段细胞表达荧光的亮度存在差别，随着时间增加荧光表达逐渐增强；SDS-PAGE 电泳后用考马斯亮蓝染色显示在27kDa 附近可看到明显条带,而未转染细胞不存在。Western-blot 结果证实SEA蛋白的表达成功；淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48h 实验组肿瘤细胞明显少于对照组，表明DU145 细胞与淋巴细胞共同培养的过程中,转染SEA基因的肿瘤细胞相对未转染的细胞更易被淋巴细胞捕获杀伤，对淋巴细胞有一定的趋化作用；ELISA 检测TNF和IL-2分泌量实验组均高于对照组。
　　 结论：成功构建了表达超抗原SEA基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG504-SEA。证明其具有体外刺激淋巴细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用，对肿瘤细胞周围的细胞因子分泌存在促进作用。

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论文说明：缩略词表

引言

第一部分装载超抗原SEA 基因的由前列腺特异性抗原和端粒酶逆转录酶启动子双调控靶向前列腺癌的溶瘤腺病毒载体的构建与鉴定

第二部分表达超抗原SEA 基因的双调控溶瘤腺病毒SG504-SEA 靶向治疗前列腺癌研究

参考文献

综述一溶瘤腺病毒及其靶向治疗肿瘤研究进展

综述二启动子克隆与预测

综述三泌尿外科腹腔镜发展的未来

攻读学位期间公开发表的论文

致谢