西红花花柱离体培养技术及培养物特征特性的研究

摘要

西红花(Crocus sativus Linn)为鸢尾科番红花属球根类多年生草本植物,属珍稀药用植物,也是日用化工染料与食品香料制品的天然原料。在传统栽培与生产方式下,球茎繁殖系数和柱头产量极低,造成资源短缺,价格昂贵。因此,应用植物组织培养技术以高效生产西红花药用组织及活性成分的研究业已受到人们。的关注。鉴于西红花药用部位仅限柱头的特殊性,本研究以西红花的花柱、柱头和雄蕊为初代培养试验材料,花柱培养物为继代培养试验材料,对初代培养和继代培养过程中培养物的增殖生长、器官分化、特征特性的变化及其影响因素进行了分析,探讨了离体成花、花柱培养物干燥处理及活性成分检测的优化条件,初步建立了以西红花活性成分生产为目标的花柱离体培养技术体系,主要取得以下实验结果：
　　 ⑴在西红花初代培养试验中,探讨了外植体种类及处理方式、接种方法对培养效果的影响。结果表明,采用改良的一步灭菌法、适宜的切割方式与接种方式能够获得污染少、出愈率高的培养效果；不同发育阶段的花柱都能诱导形成愈伤组织,与柱头和雄蕊相比,花柱是更为适合的外植体材料。
　　 ⑵在西红花花柱初代培养过程中,生长素是诱导花柱愈伤组织形成的重要影响因子,在2.0-8.0 mg／L浓度范围内,较低浓度的NAA有利于愈伤组织的形成,细胞分裂素6-BA的作用相对较弱,但与生长素之间具有显著的互作效应,在配合使用NAA2.0mg／L与6-BA1.0mg／L的激素条件下出愈率最高,对花柱脱分化形成愈伤组织最为有利；其次,花柱主要形成三种不同类型的愈伤组织,其生长量、色泽、质地、均匀性等外观特性受激素条件的影响比较显著,在MS+6-BA5.0 mg／L+NAA2.0 mg／L+2,4-D2.0 mg／L培养基中,可获得生长快、外观特性良好的愈伤组织,由此初步建立了西红花花柱诱导愈伤组织的初代培养技术体系。
　　 ⑶在西红花花柱初代培养过程中,也发生了愈伤组织的花器官分化或离体成花。在供试培养基及培养条件下,雄蕊和花柱表现不同的分化方式,前者直接分化形成花或花器官,后者则首先脱分化形成愈伤组织,再由愈伤组织分化形成花或花器官,而柱头未见花器官的形成:发育较为成熟的花柱(A2)作为外植体时,多形成具有柱头(或柱头状结构)+花瓣状结构的“完全花”,易于培养离体成花,而幼嫩花柱(A1)则多形成花瓣或花瓣状结构,无柱头或柱头状结构的形成,但两种外植体均无雄蕊或类似结构的形成；细胞分裂素(6-BA)与生长素(NAA)的激素配比对花器官分化类型起着主要作用,6-BA／NAA较高时有利于柱头状结构的形成；在花柱离体成花过程中,NAA的使用效果最好,IBA.次之,2,4-D最差。
　　 ⑷在长期继代(第6-18代)培养过程中,西红花花柱培养物出现了多种类型的形态分化,研究结果表明其形态特征与化学成分的积累具有一定相关性,并且受激素条件的影响比较显著,基本确立了花柱培养物中6种主成分产生所需的激素条件；其次,花柱培养物的增殖能力、生长量、外观特性等,也随培养次数的增加呈现不稳定性,其中增殖能力大多呈现先下降、后增强的变化趋势,而外观特性(颜色、质地、均匀性)的变化趋势呈现不确定性,但在MS+6-BA5.0mg／L+NAA5.0mg／L培养基中,能够保持其质地和器官分化能力的相对稳定。
　　 ⑸本研究确定的样品前处理方法有利于提高西红花培养物的外观品质,烘干前的预处理温度对化合物种类和含量具有显著影响,而在适宜温度预处理下烘干温度的影响相对较小,研究表明80℃预处理和烘干温度40℃的干燥条件有利于优良感官品质的形成。
　　 ⑹试验结果表明,不同类型的培养物及不同提取方法可分别检测到各具特征峰的不同化学成分；在西红花花柱的高代培养物中含有水溶性多糖、黄酮类、生物碱与酚类、皂苷、鞣质、有机酸、蒽醌类、香豆素与萜类内酯、甾体或二萜类等多类化合物,其中总黄酮和多糖含量与天然柱头之间未检测到显著差异；在花柱高代培养物所含的17种以上化学成分中,至少包含了天然柱头中的cis-5-tGcrocetin ester(350 nm)、cis-3-Gg crocetin ester(290 nm／200 nm)、Tribulusterine(268nm)、Tamarixetin o-kaempferol biflavonoid hexoside或Kaempferol esterofoedderivative(270 nm)等。