抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体制备以及慢病毒介导ppGalNAc-T2基因表达对白血病细胞恶性表型的影响

摘要

第一部分：鼠抗人ppGalNAc—T2单克隆抗体的制备及应用
　　 目的：O—糖基化异常与多种疾病密切相关，ppGalNAc—Ts酶家族作为催化黏蛋白型O—聚糖合成的起始酶，在肿瘤中出现的ppGalNAc—Ts异常表达已经被认为是肿瘤特异聚糖结构产生的重要机制之一。有研究发现，与正常组织或细胞相比，ppGalNAc—T2在结肠癌、乳腺癌等肿瘤中存在异常表达。为了研究ppGalNAc—T2基因在表达及其功能，本实验制备特异性抗人ppGalNAc—T2单克隆抗体，并对该抗体的特性及应用进行分析。
　　 方法：(1)抗原制备：利用PCR的方法从人293T细胞中克隆ppGalNAc—T2的编码区cDNA，构建pET—32a(+)—ppGalNAc—T2原核表达重组载体，载体经鉴定后转化至大肠杆菌BL21宿主菌，采用自动诱导方案表达ppGalNAc—T2融合蛋白；融合蛋白经凝胶纯化并鉴定后获得免疫用抗原；(2)杂交瘤及单克隆抗体制备：免疫BAILB/c小鼠，利用细胞融合技术构建杂交瘤细胞，经间接ELISA和流式细胞术双筛选方法来获得稳定、高效分泌抗ppGalNAc—T2抗体的杂交瘤细胞株；然后采用小鼠体内腹水诱生法大量制备腹水型单抗；(3)单克隆抗体特性分析及其应用：测定单克隆抗体的亚类，然后将单克隆抗体用于间接ELISA，原核蛋白及真核蛋白的Western Blot分析，流式细胞术以及细胞免疫荧光分析。
　　 结果：筛选出一株稳定分泌抗人ppGalNAc—T2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为LW—5F3，保减号NO．C2010106；该单抗亚类为IgMκ；Western blot分析该单克隆抗体不仅识别原核表达的ppGalNAc—T2融合蛋白，还特异识别L929—ppGalNAc—T2转基因细胞表达的ppGalNAc—T2真核蛋白；流式细胞术分析检测到白血病Jurkat细胞和肝癌HepG2细胞均表达ppGalNAc—T2蛋白，并对肝癌HepG2细胞中ppGalNAc—T2蛋白表达情况进行了免疫荧光分析。
　　 第二部分：慢病毒介导ppGalNAc—T2基因表达对白血病细胞恶性表型的影响
　　 目的：白血病细胞株在经全反式维甲酸诱导分化过程中ppGalNAc—T2基因出现表达异常，而且有研究发现抑制O—糖基化可影响结肠癌和淋巴瘤等肿瘤的生长恶化。我们推测ppGalNAc—T2的表达及其控制合成的O—糖链在白血病中可能有着重要的作用。为此我们利用慢病毒转染手段，来研究ppGalNAc—T2基因表达对白血病Jurkat细胞恶性表型的影响，来探讨O—糖基化在白血病中的作用。
　　 方法：(1)慢病毒过表达载体构建：利用PCR的方法从人293T细胞中克隆ppGalNAc—T2的编码区cDNA，构建慢病毒重组质粒venus—ppGalNAc—T2，将重组质粒及包装质粒共转染至293T细胞产生病毒颗粒，毒液经纯化并进行滴度测定；(2)慢病毒RNAi载体构建：设计并合成靶向沉默ppGalNAc—T2基因表达的shRNA及negative control，经退火后连接至慢病毒载体YH1上，病毒产生及滴度测定等操作同上；(3)白血病Jurkat细胞转染：将(1)和(2)所得慢病毒感染Jurkat细胞，然后进行经流式分选仪分选YFP阳性细胞，每个单细胞单独培养为单克隆细胞株，经流式细胞术，半定量RT—PCR和Western blot鉴定后，获得Jurkat细胞ppGalNAc—T2过表达及RNAi模型；(4)实验分析ppGalNAc—T2表达改变后，Jurkat细胞增殖、粘附以及TransWell迁移能力的改变。
　　 结果：成功构建了重组慢病毒ppGalNAc—T2过表达载体和慢病毒RNAi载体，感染Jurkat细胞经流式细胞仪分选，半定量RT—PCR和Western blot实验鉴定获得了稳定转染Jurkat细胞株；MTT实验，细胞粘附实验和Transwell细胞迁移实验分析表明ppGalNAc—T2过表达可促进Jurkat细胞的增殖，粘附及细胞迁移能力；当ppGalNAc—T2表达被RNAi沉默后，Jurkat细胞的增殖，粘附和迁移能力降低。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一部分 抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体的制备及应用

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 慢病毒介导ppGalNAc-T2表达对白血病细胞恶性表型的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述

参考文献

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