伤寒沙门菌质粒pRST98和毒力基因spv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究

摘要

目的:通过细胞感染模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98和沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene，spv)对巨噬细胞(macrophage)自噬和凋亡的影响及其分子机制。
　　 方法:
　　 一.伤寒沙门菌质粒pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。
　　 以携带pRST98的伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.typhi)野生株ST8、消除pRST98的突变株ST8-⊿pRST98和将pRST98经接合转移重新导入ST8-⊿pRST98所获得的回补株ST8-c-pRST98感染人巨噬细胞THP-1，以此作为感染模型，分别用自噬诱导剂雷帕霉素( Rapamycin，RAPA)和NO合酶抑制剂L-硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）进行干预。将细菌和细胞共培养30 min后吸除上清，此时定为“0点”，加入含100μg/ml的阿米卡星(Amikacin，AMK)的培养液作用2h以去除胞外菌，然后将AMK浓度降为10μg/ml抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长，继续培养至各检测时间点。分别在细胞感染模型的0点、感染后2h和6h收集细胞或上清液。用流式细胞术(flowcytometry，FCM)检测巨噬细胞自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein1 light chain3，LC3)-Ⅱ的表达和Sub-G1凋亡峰，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察细胞超微结构的变化，Western blot法检测巨噬细胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，比色法测定Caspase-3的活性，Griess法检测NO(nitric oxide)含量，ELISA法检测TNF-α含量，平板菌落计数法检测胞内活菌数。
　　 二.沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。
　　 由于伤寒沙门菌只感染人类的严格宿主特异性，缺乏理想的动物模型，为今后进一步在动物活体内研究pRST98上spv的功能，本部分实验使用鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S.typhimurium）开展相应实验，以携带sPv的鼠伤寒沙门菌野生株UF009和敲除spv的鼠伤寒沙门菌突变株UF110感染鼠巨噬细胞J774A.1，以此作为感染模型，并用p38抑制剂SB203580进行干预。细菌和细胞共培养1h后吸除上清，此时定为“0点”，AMK的应用同第一部分。分别在细胞感染模型的0点、感染后2h、6h和24 h收集细胞或上清液进行相关指标的检测。用FCM检测巨噬细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达和Sub-G1凋亡峰，Western blot法检测巨噬细胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，Griess法检测NO的含量。
　　 结果:
　　 一.伤寒沙门菌质粒pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。
　　 1.FCM和Western blot检测自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1结果显示，细胞感染模型的0点，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表达量均显著低于ST8-⊿pRST98组;感染后2h，各感染组细胞LC3-Ⅱ(P＞0.05)和Beclin-1的表达量未见明显差异。
　　 2.FCM检测Sub-G1凋亡峰结果显示，感染后2h，各感染组细胞凋亡率未见明显差异(P＞0.05);感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞凋亡率显著高于ST8-⊿pRST98组(P＜0.01)。电镜结果与FCM检测结果一致，感染后2h，各感染组细胞均可见染色质边聚等凋亡改变，但各组细胞的凋亡现象未见明显差异;感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组凋亡细胞明显多于ST8-⊿pRST98感染组。Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2，亦发现感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞Bcl-2表达量显著低于ST8-⊿pRST98组。
　　 3.比色法检测Caspase-3活性结果显示，感染后2h，各感染组细胞Caspase-3活性未见明显差异（P＞0.05）;感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞Caspase-3活性高于ST8-⊿pRST98组（P＜0.05）。
　　 4.细胞上清液中NO和TNF-α测定结果显示，感染后2h和6h，ST8和ST8-cpRST98感染组细胞NO(P＜0.01)和TNF-α（2h，P＜0.01;6h，P＜0.05）产生量均低于ST8-⊿pRST98感染组。而平板菌落计数法检测细胞内活菌数结果显示，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞内活菌数高于ST8-⊿pRST98感染组（2h，P＜0.05;6h，P＜0.01)。
　　 5.用自噬诱导剂RARA干预后，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞的凋亡率(P＜0.01)和细胞内活菌数降低(2h，P＜0.05;6h，P＜0.01)，而ST8-⊿pRST98感染组未见明显变化(P＞0.05)。
　　 6.用NO合酶抑制剂L-NAME干预后，ST8-⊿pRST98感染组细胞LC3-Ⅱ表达量显著下降(P＜0.01)，凋亡率(P＜0.01)和Caspase-3活性(P＜0.05)上升，而ST8和ST8-c-pRST98感染组未见明显变化(P＞0.05)。
　　 二.沙门菌质粒毒力基因sPv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。
　　 1.FCM和Western blot检测自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1结果显示，细胞感染模型的0点，UF009感染组细胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表达量均显著低于UF110感染组;感染后2h，UF009和UF110感染组细胞LC3-Ⅱ（P＞0.05）和Beclin-1的表达量未见明显差异。
　　 2.用p38的抑制剂SB203580干预后，细胞感染模型的0点，UF009感染组细胞LC3-Ⅱ（P＞0.05）和Beclin-1的表达量未见明显变化，而UF110感染组细胞LC3-Ⅱ(P＜0.01)和Beclin-1的表达量显著下降。
　　 3.FCM检测Sub-G1凋亡峰结果显示，感染后2h，UF009和UF110感染组细胞凋亡率未见明显差异(P＞0.05);感染后6h和24 h，UF009感染组细胞凋亡率显著高于UF110感染组(P＜0.01)。Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2结果显示，感染后2h，UF009和UF110感染组细胞Bcl-2的表达量未见明显差异;感染后6h，UF009感染组细胞Bcl-2的表达量略低于UF110感染组，两组之间差异不显著;感染后24 h，UF009感染组细胞Bcl-2的表达量显著低于UF110感染组。
　　 4.用p38的抑制剂SB203580干预后，FCM结果显示，感染后6h和24 h，UF009感染组细胞凋亡率未见明显变化(P＞0.05)，而UF110感染组细胞凋亡率上升(P＜0.05); Western blot结果显示，感染后24 h，UF009感染组细胞Bcl-2表达量未见明显变化，而UF110感染组细胞Bcl-2表达量显著下降。
　　 5.Griess法检测细胞上清液中NO结果显示，感染后2h、6h和24 h，UF009感染组细胞NO产生量均显著低于UF110感染组(P＜0.01)。
　　 6.用p38抑制剂SB203580干预后，各时间段UF009感染组细胞NO产生量未见明显变化(P＞0.05)，而UF110感染组细胞NO产生量显著降低(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 以上实验结果表明，伤寒沙门菌质粒pRST98在感染早期通过抑制巨噬细胞自噬抵抗杀菌作用，使细菌在细胞内的活菌数量增加，而在后期则诱导细胞凋亡。用自噬诱导剂RAPA干预细胞感染模型并激活自噬，能够减轻携带pRST98的伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡。pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响与该质粒抑制细胞NO及TNF-α的产生有关。沙门菌质粒毒力基因sPv能抑制巨噬细胞自噬并促进凋亡，用p38的抑制剂SB203580干预细胞感染模型能使敲除spv的突变株诱导的巨噬细胞自噬减弱而凋亡增强，说明sPv的作用与p38信号通路密切相关。

目录

声明

苏州大学学位论文使用授权声明

中文提要

英文提要

引言

第一部分 伤寒沙门菌质粒pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究

1．材料与方法

2．结果

第二部分 沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究

1．材料与方法

2．结果

讨论

小结

参考文献

综述

英文缩略词表

攻读学位期间公开发表论文

致谢