β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(β3Gn-T8)对人脑星形胶质瘤侵袭和增殖的影响

摘要

本研究旨在探讨β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8(β3Gn-T8)对胶质瘤侵袭及增殖的影响。通过对胶质瘤细胞恶性表型相关因子、成瘤模型及临床标本的相关指标检测分析，来了解β3Gn-T8在胶质瘤的发生发展中扮演的重要作用，为治疗人恶性胶质瘤提供一个新的有效的辅助分子治疗方法。
　　 目的:
　　 (1)探讨糖基转移酶β3Gn-T8在人脑胶质瘤组织与正常脑组织中表达的差异。
　　 (2)在人胶质瘤U251细胞水平探讨糖基转移酶β3Gn-T8对胶质瘤侵袭及增殖能力的影响，以及β3Gn-T8与MMP-2的关系。
　　 (3)观察糖基转移酶β3Gn-T8对胶质瘤U251细胞裸鼠皮下种植瘤生长的影响。
　　 (4)探讨糖基转移酶β3Gn-T8对肿瘤细胞多聚乳糖胺链的影响。
　　 方法:
　　 (1)运用免疫组织化学方法，在人脑星形胶质瘤和正常脑组织的石蜡标本上，分别检测β3Gn-T8的表达情况并分析其差异。收集相关胶质瘤组织标本的临床病理参数，通过统计学方法分析胶质瘤β3Gn-T8表达与临床病理参数的关系。
　　 (2)将β3Gn-T8的真核表达正义载体pEGFP-C1-T8及空载体pEGFP-C1、RNA干扰载体pSilenCircle-T8Si及对照载体pSilenCircle-T8Scr，通过脂质体转入人星形胶质瘤U251细胞，经G418筛选出稳定细胞株，RT-PCR挑选出上调、下调β3Gn-T8最优的细胞株。将细胞分为五组:U251转染正义载体组(T8S)与空载体组(Mock)、U251转染干扰载体组(T8Si)与对照载体组(T8Scr)、U251未转染组(NC)。RT-PCR、Western blot及免疫荧光检测五组细胞β3Gn-T8的表达，并用流式细胞术分析β3Gn-T8高/低表达细胞株的多聚乳糖胺链的变化。
　　 (3)在体外实验中，通过MTT检测以上各组细胞生长状况，集落形成实验检测各组细胞单细胞形成集落的能力;Boyden小室和划痕修复实验检测各组细胞侵袭迁移能力差异;采用RT-PCR及Western blot方法检测以上五组细胞的MMP-2、TIMP-2 mRNA及蛋白水平表达变化。
　　 (4)在体内实验中，将转染正义载体组(T8S)、干扰载体组(T8Si)及未转染组(NC)的U251细胞通过皮下接种BALB/c裸鼠的方法构建胶质瘤移植瘤模型。通过对移植瘤成瘤时间、生长曲线和最终体积指标的测量以及病理学观察，探讨β3Gn-T8对胶质瘤移植瘤增殖和侵袭能力的影响。
　　 结果:
　　 (1)临床人脑星形胶质瘤组织中β3Gn-T8蛋白表达阳性率为88.10％，显著高于正常脑组织12.5％(P＜0.01)，且β3Gn-T8蛋白的表达与胶质瘤的临床病理分级正相关(P＜0.05)。
　　 (2)通过RT-PCR和Western blot的检测，以及激光共聚焦显微镜观察各组细胞，可见载体成功转入人星形胶质瘤U251细胞，得到稳定转染细胞株。同时，流式细胞术显示，上调B3Gn-T8的表达水平，多聚乳糖胺链产量增加，下调β3Gn-T8的表达水平，多聚乳糖胺链产量减少。
　　 (3)对转染pEGFP-Cl-T8的U251细胞进行侵袭和增殖能力的系列检测，和空载体组相比较，MTT检测显示细胞的增殖能力升高(P＜0.05)，集落形成实验显示细胞集落形成能力增强;Boyden小室实验和划痕修复实验发现细胞的侵袭迁移能力增强(P＜0.05);RT-PCR及Western blot检测发现MMP-2的表达在mRNA水平及蛋白水平相应升高(P＜0.05)，而TIMP-2的表达不存在统计学意义。
　　 对转染pSilenCircle-T8Si的U251细胞进行侵袭和增殖能力的系列检测，和对照载体组相比较，MTT检测显示细胞的增殖能力下降(P＜0.05)，集落形成实验显示细胞集落数明显降低;Boyden小室实验发现细胞穿膜率较低，侵袭能力弱(P＜0.05)，划痕修复实验显示细胞划痕修复较慢，迁移能力下降(P＜0.05);RT-PCR及Western blot检测发现MMP-2的表达在mRNA水平及蛋白水平相应降低(P＜0.05)，而TIMP-2的表达不存在统计学意义。
　　 (4)人星形胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤成瘤率100％。与NC组相比，T8S组移植瘤成瘤时间较短，生长速度较快，最终体积更大(P＜0.05); T8Si组移植瘤成瘤时间延长，其生长速度和最终体积均小于NC组(P＜0.05)。移植瘤组织学呈现典型的恶性肿瘤细胞形态特点，且T8S组的移植瘤细胞向周围肌肉组织侵袭生长。
　　 结论:
　　 (1)B3Gn-T8在人星形胶质瘤组织的表达较正常脑组织显著增加，其表达与胶质瘤的临床病理分级正相关。
　　 (2)成功构建了稳定的β3Gn-T8上调及下调细胞株。
　　 (3)β3G n-T8促进了多聚乳糖胺链的合成。
　　 (4)β3Gn-T8增强了人星形胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。
　　 (5)在细胞水平，随着β3Gn-T8表达的上调，MMP-2的表达也相应升高，而TIMP-2表达水平不存在统计学意义。β3Gn-T8可能通过促使多聚乳糖胺链的合成，影响MMP-2/TIMP-2比值，打乱了两者间的平衡，而促进了U251细胞的增殖和侵袭能力。
　　 (6)β3Gn-T8增强了胶质瘤裸鼠移植瘤的增殖和侵袭能力。
　　 综上所述，糖基转移酶β3Gn-T8在人胶质瘤组织的表达与胶质瘤的临床病理分级正相关;糖基转移酶β3Gn-T8对胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力有增强作用;糖基转移酶β3G n-T8对胶质瘤细胞中的MMP-2的表达具有调控作用，推测这可能是促进胶质瘤侵袭的机制之一。

目录

声明

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前言

参考文献

第一章 β3Gn-T8在人脑星形胶质瘤组织中的表达及其与临床病理分级的关系

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二章 β3Gn-T8高/低表达U251细胞株的建立及其鉴定

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三章 β3Gn-T8高/低表达U251细胞株的行为学研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

附录

致谢