小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径

摘要

目的：
　　我们实验室以前的研究表明小脑顶核可参与调节淋巴细胞功能。由于小脑与免疫系统之间没有直接的结构上的联系，因此探讨小脑调节免疫功能的途径和机制对于更好地理解小脑的免疫调节功能具有重要的意义。下丘脑是中枢神经系统中重要的免疫调节中枢。为此，本研究一方面进一步揭示小脑顶核至下丘脑的神经投射路径及性质；另一方面，在上述研究的基础上分别研究小脑顶核至下丘脑γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）能和谷氨酸能神经投射对淋巴细胞功能的影响，以探讨小脑顶核调节免疫功能的中枢和外周途径，进一步拓宽和加深对小脑神经免疫调节的认识和理解。
　　方法：
　　1.单侧小脑顶核内微量注射葡聚糖-德克萨斯红（Texas red dextran amine, TRDA），顺行追踪顶核至下丘脑的神经投射路径及终止部位。单侧下丘脑外侧区（lateral hypothalamic area, LHA）内微量注射逆行追踪剂红色荧光金（Fluoro-Ruby, FR），结合GABA和谷氨酸免疫荧光组织化学染色，进一步确定顶核至下丘脑投射的性质。
　　2.双侧小脑顶核内微量注射GABA降解酶—GABA转氨酶的抑制剂氨已烯酸（vigabatrin,VGB）或GABA合成酶—谷氨酸脱羧酶的抑制剂3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid,3-MP），并以未作任何处理的空白大鼠和双侧小脑顶核注射等量生理盐水的大鼠作为对照。注射后第3天，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyl fluorescein succinimidyl ester, CFSE）和抗CD3抗体流式双标技术检测T淋巴细胞对刀豆蛋白A（concanavalin A, Con A）刺激的增殖反应；用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清中抗绵羊红细胞（sheep red blood cells, SRBC）特异性 IgM抗体水平；动物于第6天加强注射药物，3天后用CAM/EH-1流式双标技术检测脾脏自然杀伤（natural killer, NK）细胞杀伤肿瘤靶细胞YAC-1的活性。在检测淋巴细胞功能的同时，用FR逆行追踪结合GABA免疫组化染色检测顶核至LHA投射中GABA能神经元数目的变化，并用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）检测下丘脑中GABA的含量变化。
　　3.大鼠用小牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）进行免疫。免疫后第3天，双侧小脑顶核内微量注射谷氨酸合成酶—谷氨酰胺酶的抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON），同时双侧 LHA或丘脑腹外侧核（ventrolateral thalamic nuclei, VL）内微量注射谷氨酸膜转运体抑制剂苏式-3-羟基天冬氨酸（D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA）。动物饲养3天，用抗CD3，CD4， CD8，CD45RA和NKR-P1A抗体标记流式检测外周血中T细胞及其亚群，B细胞和NK细胞的百分比变化；用CD3/CD25和CD3/CFSE流式双标技术分别检测肠系膜淋巴结T细胞对Con A刺激的活化和增殖能力；用real-time PCR法检测淋巴结T细胞中细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-10，TGF-β，IL-22，IL-17 mRNA的表达及用ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，TGF-β，IL-22， IL-17的水平。此外，大鼠B细胞抗BSA IgM和IgG抗体生成能力及脾脏NK细胞的杀伤活性也分别用 ELISA法及流式细胞术进行检测。在检测上述淋巴细胞功能的同时，同样用FR逆行追踪结合谷氨酸免疫组化染色检测顶核至LHA投射中谷氨酸能神经元数目的变化，以及用HPLC法检测下丘脑及丘脑组织中谷氨酸含量的变化。
　　4.注射DON及THA后第3天，用ELISA法检测血清中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone,ACTH），皮质醇（cortisol），促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH），三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine,T3）及甲状腺素（thyroxin,T4）的水平，用HPLC法进行检测外周免疫器官脾脏及淋巴结中去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）的含量变化。
　　结果：
　　1.顶核神经元发出的TRDA阳性纤维，在小脑上脚中走行，至小脑上脚交叉处交叉至对侧，并进入下丘脑，主要终止于LHA。在LHA注射逆行追踪剂FR，标记的阳性纤维逆行穿行于小脑上脚交叉，并可到达小脑顶核。结合免疫荧光组织化学染色发现顶核投射到LHA的神经元既有GABA能又有谷氨酸能。
　　2.双侧顶核注射VGB导致肠系膜淋巴结T细胞对Con A诱导的增殖反应，血清中抗SRBC IgM抗体水平及脾脏NK细胞杀伤肿瘤YAC-1靶细胞的杀伤活性均低于空白组及顶核注射生理盐水的对照组。而双侧顶核注射3-MP，可导致相反的变化。与此同时，顶核注射VGB可显著增加顶核至LHA投射中GABA能神经元的数目和下丘脑中GABA的含量，而顶核注射3-MP，顶核至LHA投射中GABA能神经元的数目和下丘脑中GABA的含量均降低。
　　3.双侧顶核注射DON后，外周血中CD3+T细胞，CD3+CD4+T细胞数目及CD4/CD8比值均低于空白组和顶核注射生理盐水的对照组，而CD3+CD8+T细胞数目没有显著变化；肠系膜淋巴结T细胞的活化和增殖能力降低；淋巴结T细胞致炎细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-17，IL-22的mRNA表达及在细胞培养上清中的含量均显著低于空白组和生理盐水对照组，而抗炎细胞因子IL-4，IL-10，IL-5，TGF-β的mRNA表达和培养上清中IL-4，IL-10，TGF-β的含量没有显著变化。另外，外周血中B细胞数目及血清中抗BSA IgM和IgG水平也明显下降。外周血中NK细胞数目及脾脏NK细胞杀伤活性也明显降低。与此同时，顶核注射DON后，顶核至LHA投射中谷氨酸能神经元的数量及下丘脑中谷氨酸的含量也降低。顶核注射DON联合LHA注射THA可使上述外周血中CD3+及CD3+CD4+T细胞数目和CD4/CD8比值，淋巴结T细胞的活化和增殖，致炎细胞因子的mRNA表达和细胞培养上清中的含量都显著高于单独顶核注射DON组。此外，外周血中B细胞数目及血清中抗BSA抗体水平，外周血中NK细胞数目及脾脏NK细胞杀伤活性也均高于单纯顶核注射DON组。同时下丘脑中谷氨酸的含量也比单纯顶核注射DON组有所升高。顶核至VL也有直接的谷氨酸能神经投射，而顶核注射DON的同时VL注射THA，虽然丘脑中谷氨酸的含量较单纯顶核注射DON有所升高，但上述T，B，NK细胞的数目和功能降低没有显著改变。
　　4.双侧顶核注射DON可导致脾脏和淋巴结中NE含量高于空白组和生理盐水对照组，联合LHA注射THA后脾脏和淋巴结中NE含量较单纯注射DON组有所降低。动物注射DON及THA，血清中ACTH，皮质醇，TSH，T3及T4的水平没有显著变化。
　　结论：
　　1.小脑顶核发出直接的神经纤维投射至下丘脑，主要终止于LHA；这些神经投射中有GABA能和谷氨酸能纤维。
　　2.小脑顶核的GABA能神经元调节T、B和NK细胞的功能，此调节作用由顶核至下丘脑的GABA能神经投射所介导。
　　3.小脑顶核的谷氨酸能神经元调节T、B和NK细胞的数目和功能，这种调节作用由顶核投射至下丘脑而不是投射至丘脑的谷氨酸能神经所介导。
　　4.交感神经而非肾上腺皮质和甲状腺激素途径介导小脑顶核—下丘脑谷氨酸能神经投射的免疫调节作用。
　　5.综合上述结果，提示顶核GABA能/谷氨酸能神经元→下丘脑→交感神经→淋巴细胞途径参与介导了小脑顶核对免疫系统功能的调节。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前言

材料与方法

1 材 料

2 方 法

结果

1 小脑顶核至下丘脑的神经投射路径及终止部位

2 小脑顶核至下丘脑具有GABA能和谷氨酸能神经投射

3 小脑顶核至下丘脑的GABA能神经投射介导小脑的免疫调节

4 小脑顶核至下丘脑的谷氨酸能神经投射介导小脑的免疫调节

讨论

结论

参考文献

综述

英文缩写词表

攻读学位期间公开发表的论文

博士生期间承担科研项目情况

致谢