自噬在系统性炎症所致黑质多巴胺神经元损伤中的作用及机制研究

摘要

第一部分：系统性炎症导致黑质多巴胺神经元慢性、进行性缺失和α-synuclein病理性蓄积
　　目的：建立系统性炎症诱导的PD小鼠模型，研究系统性炎症对黑质多巴胺神经元的慢性损伤作用和α-synuclein降解的影响。
　　方法：选取3、16月龄C57BL雄性小鼠作为年轻和老龄小鼠，单次腹腔注射细菌脂多糖（LPS,5mg/kg），进行爬杆试验和步距测试的运动功能检测；免疫组化法观察黑质多巴胺神经元数量、小胶质细胞活化状态变化和IL-1β的阳性表达，免疫印迹法检测腹侧中脑（黑质）α-synuclein蛋白表达水平；聚合酶链式反应法检测α-synuclein转录水平。
　　结果：与正常对照组比较，16月龄小鼠于LPS注射后4-5m开始出现运动功能障碍，随时间延长进一步加剧，而3月龄组出现较晚，延迟至 LPS注射后7m才出现（*P<0.05）；LPS注射后1d-7m整个观察期内，两个年龄组小鼠黑质部位小胶质细胞数量明显增加，同时IL-1β阳性表达明显增加，16月龄组的变化更显著；LPS注射后5m，16月龄组小鼠黑质多巴胺神经元数量出现减少（27%），7m时进一步降低（41%），3月龄组延迟至 LPS注射后7m，开始出现减少（22%）；LPS注射后1d-7m整个观察期内两个年龄组小鼠腹侧中脑（黑质部位）α-synuclein蛋白表达水平均显著增加（**P<0.01），同期α-synuclein转录水平无显著变化。
　　结论：通过单次腹腔注射细菌脂多糖可成功建立PD模型，小鼠黑质部位出现持续性神经炎症，多巴胺神经元慢性、进行性缺失，以及α-synuclein长期病理性蓄积。
　　第二部分：系统性炎症导致中脑黑质自噬活性改变和多巴胺神经元自噬功能障碍
　　目的：利用第一部分建立的PD模型，研究PD发病过程中黑质部位自噬活性变化。
　　方法：选取3、16月龄的C57BL雄性小鼠作为年轻和老龄小鼠，细菌脂多糖（LPS，5mg/kg）单次腹腔注射制作PD模型，免疫印迹法检测腹侧中脑（黑质） LC3-Ⅱ、p62和HDAC6蛋白表达水平；透射电镜观察黑质神经元超微结构，免疫荧光共聚焦技术观察多巴胺神经元内LC3、p62的表达。离体实验中，以不同浓度TNF-a处理低分化PC12细胞，MTT方法检测细胞存活率；免疫印迹法检测LC3-Ⅱ、p62和 a-synuclein蛋白表达水平，聚合酶链式反应法检测 p62和 a-synuclein转录水平。
　　结果：与正常对照组比较，LPS注射后1d-7m两个年龄组小鼠腹侧中脑（黑质）均出现p62蛋白表达增加（**P<0.01）； LC3-Ⅱ和HDAC6蛋白表达量均出现先增加后减少的动态变化（**P<0.01），与3月龄比较，16月龄组LC3-Ⅱ和HDAC6蛋白表达下降更早出现；与正常对照组比较，LPS注射后1d，黑质神经元内可见双层膜结构的自噬体；而且多巴胺神经元出现LC3和p62的阳性表达；离体实验结果表明，TNF-α呈浓度依赖性地降低PC12细胞存活率（**P<0.01）；TNF-α(50 ng/ml)处理24h，PC12细胞内α-synuclein、LC3-Ⅱ和 p62蛋白表达水平增加（*P<0.05），而α-synuclein和p62转录水平无显著变化。
　　结论：单次腹腔注射细菌脂多糖建立的PD模型中，黑质部位自噬出现早期自噬激活、后期自噬活性下降的动态变化；炎症可导致多巴胺神经元的自噬激活但自噬流不能完成；炎症因子TNF-α能诱导多巴胺神经细胞出现自噬功能障碍，引起α-synuclein降解障碍。
　　第三部分：米诺环素预处理能减轻系统性炎症所致中脑黑质急性炎症和自噬功能障碍
　　目的：研究米诺环素预处理对中脑黑质部位急性炎症和自噬活性的调节作用。
　　方法：3月龄C57BL雄性小鼠，米诺环素预给药三天，最后一次注射1h后，腹腔注射脂多糖（LPS，5mg/kg），进行爬杆试验和步距测试的运动功能检测；免疫组化方法观察黑质小胶质细胞的活化状态、IL-1β的阳性表达；酶联免疫吸附方法检测TNF-α水平；免疫印迹法检测黑质部位LC3-Ⅱ、HDAC6、p62和α-synuclein蛋白表达水平；免疫荧光共聚焦技术观察多巴胺神经元内LC3、p62的表达。
　　结果：与正常对照组比较，LPS注射后1d，小鼠出现明显运动功能障碍，黑质部位小胶质细胞活化数量增加、TNF-α水平和 IL-1β阳性表达增加，LC3-Ⅱ、HDAC6、p62和α-synuclein蛋白表达水平同步增加（**P<0.01）；与单独脂多糖组比较，低剂量（25mg/kg）和中剂量（50mg/kg）米诺环素干预组小鼠运动功能障碍有所改善；黑质部位小胶质细胞活化数量、TNF-α水平和IL-1β阳性表达均明显减少，同时α-synuclein和 LC3-Ⅱ、HDAC6、p62的蛋白表达水平也明显下降（**P<0.01）；中剂量（50mg/kg）米诺环素干预组多巴胺神经元内LC3和p62阳性表达明显减少；高剂量（75mg/kg）米诺环素干预组小鼠运动功能障碍有所加重，黑质部位 LC3-Ⅱ和HDAC6蛋白表达水平同步增加，p62和α-synuclein蛋白表达水平也有所增加。
　　结论：在一定的剂量范围内，米诺环素预处理能减轻黑质部位的炎症反应，缓解该部位自噬功能障碍，减少α-synuclein病理性蓄积。

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中文摘要

英文摘要

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序言

参考文献

第一部分：系统性炎症引起黑质多巴胺神经元慢性、进行性缺失和α-synuclein病理性蓄积

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：系统性炎症导致黑质自噬活性动态变化和多巴胺神经元自噬功能障碍

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分：米诺环素预处理减轻系统性炎症所致中脑黑质急性炎症和自噬功能障碍

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文及科研成果

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致谢