低剂量X线照射用于无菌性假体松动早期治疗可行性的基础研究

摘要

第一部分、Ti颗粒对成骨样细胞MC3T3-E1的毒性试验
　　目的：验证所使用的Ti颗粒对成骨样细胞的细胞毒性。明确用于后续实验合适的Ti颗粒浓度
　　方法：不同浓度Ti颗粒0,10,50,100,1000（Ti颗粒数/细胞数；分别命名为Ti-0，Ti-10，Ti-50，Ti-100，Ti-1000组）与MC3T3-E1细胞共同培养，48小时后观察 Ti颗粒被MC3T3-E1细胞的吞噬情况，采用CCK8试剂盒测定不同浓度Ti钛颗粒对MC3T3-E1细胞的细胞毒性。14天后，采用茜素红染色观察矿化结节，并用氯化十六烷基吡啶进行半定量分析。采用ALP试剂盒，测定Ti颗粒对MC3T3-E1细胞ALP分泌的影响；Real Time-PCR测定Col1α1,IL-6的表达；
　　结果：MC3T3-E1细胞与Ti颗粒共培养48小时，可见Ti颗粒明显被细胞吞噬。随着Ti颗粒浓度的增加，Ti颗粒对成骨细胞的毒性逐渐增加，Ti-1000时，MC3T3-E1细胞的细胞活性仅为对照组Ti-0组的28.3％；14天后茜素红染色及半定量分析结果显示，随着Ti颗粒浓度的升高，MC3T3-E1细胞的矿化逐渐增加，在Ti-100达到高峰，当Ti-1000时，MC3T3-E1细胞的矿化降低。Real-Time PCR显示Ti-100，Ti-1000均显著抑制了MC3T3-E1细胞Col1α1的表达，但Ti-1000对IL-6的表达也出现抑制趋势。共培养7天，ALP活性结果显示Ti-100在第7天和第14天均显著抑制了MC3T3-E1细胞的ALP活性；
　　结论：本课题选用的Ti颗粒可有效地被MC3T3-E1细胞吞噬，随着Ti颗粒浓度的升高，Ti颗粒的毒性逐渐增加；对于细胞的分化，Ti颗粒浓度达到Ti-100时，明显抑制了成骨样细胞的功能，但同时不至于严重影响细胞的活性。对于细胞的矿化，Ti颗粒并没有抑制成骨样细胞的矿化，反而具有促进作用，这可能是由于细胞外未被吞噬的Ti颗粒提供的粗糙面粘附了较多的纤维蛋白导致，而与成骨细胞的功能和活性可能无关。
　　第二部分、低剂量X线照射对Ti颗粒刺激后MC3T3-E1细胞的影响
　　目的：明确LDI是否会加重Ti颗粒对成骨样细胞的影响；明确在Ti颗粒存在情况下，LDI是否能够促进成骨样细胞的分化；明确LDI对Ti颗粒刺激后成骨样细胞IL-6表达的影响
　　方法：不同浓度Ti颗粒与MC3T3-E1细胞共同培养，24小时后接受0.5Gy X线照射，照射后24小时、48小时、72小时后采用CCK8试剂盒测定MC3T3-E1细胞的活性。照射后3天、7天后采用ELISA法测定上清液中PICP的浓度；照射后7天、14天采用ALP试剂盒测定细胞裂解液的ALP活性；照射后5天，提取细胞内总RNA，反转录，行Real-Time PCR对IL-6基因的表达进行相对定量分析。照射后14天采用茜素红染色观察MC3T3-E1细胞的矿化并采用氯化十六烷基吡啶进行半定量分析。
　　结果：Ti颗粒在24小时、48小时、72小时，对MC3T3-E1细胞的活性均有显著地抑制效应。照射后24小时，LDI对细胞的活性没有显著影响，但是48小时和72小时后，LDI对MC3T3-E1细胞的活性也出现抑制效应，同时会加重Ti颗粒的影响。照射后3天，Ti-100组PICP的浓度显著下降，在第7天时仍有明显差异。LDI,在照射后3天对PICP浓度的影响没有统计学差异，但第7天时，LDI照射后，各组PICP的浓度都有升高趋势，双因素方差分析显示差异具有统计学意义。ALP碱性磷酸酶活性检测显示照射后7天，Ti颗粒因素对MC3T3-E1细胞的ALP活性影响具有统计学差异，但照射因素对ALP活性的影响没有统计学差异。照射后14天，Ti颗粒因素对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响仍然存在，Ti颗粒各浓度组，照射后细胞的ALP活性均高于假照射组，差异具有统计学意义。Real-Time PCR结果显示LDI可有效降低Ti颗粒刺激后MC3T3-E1细胞IL-6的表达。茜素红染色显示在Ti颗粒存在的情况下LDI仍具有促进矿化的效应。
　　结论：LDI早期会加重Ti颗粒对成骨样对细胞增殖的影响，但LDI不会加重Ti颗粒对成骨样细胞分化的影响，反而在Ti颗粒存在的情况下仍具有促进成骨样细胞分化、矿化的作用，同时LDI可下调Ti颗粒刺激后成骨样细胞IL-6的表达。
　　第三部分、低剂量X线照射与Ti颗粒对兔股骨远端植入假体骨整合的影响
　　目的：明确LDI对兔股骨远端植入假体骨整合的影响，及对Ti颗粒注射后兔股骨远端植入假体骨整合的影响
　　方法：将20只新西兰白兔随机分为照射组与对照组，每组动物建立假体植入模型，右膝注入0.2ml生理盐水，左膝注入0.2ml Ti颗粒悬液模拟磨损颗粒。最终动物模型根据处理方式的不同分为四组，分别为0Gy-NS：注射生理盐水假照射组；0Gy-Ti：注射Ti颗粒悬液假照射组；0.5Gy-NS：注射生理盐水照射组；0.5Gy-Ti：注射Ti颗粒悬液照射组。分别于术前（0天），术后2周，4周，8周静脉采血，行ELISA测定PINP浓度。处死前2周及4天分别注射钙黄绿素，二甲酚橙进行荧光标记。术后8周处死动物，搜集双侧股骨，行Micro-CT扫描，分析假体周围骨小梁结构；术后8周，每组3个标本进行硬组织包埋，切片，荧光纤维镜观察并测定成骨速率，SVG染色观察假体周围组织结构。Micro-CT扫描后标本进行生物力学压出试验，测定假体最大压出力。
　　结果：Micro-CT结果显示LDI显著增加了NS注射侧的BV、BV/TV、Tb.N、BMD,同时使假体周围骨小梁SIM下降，Ti颗粒仅使假体周围DA下降，同时LDI可逆转这一效应。照射组与对照组，术后血清中的PINP含量均明显升高，术后2周达到高峰，术后8周两组均接近术前水平，但是照射组术后8周的水平仍高于术前水平，差异具有统计学意义。术后两周，照射组与对照组相比，血清PINP升高更为明显，差异具有统计学意义。硬组织切片的SVG染色可以发现，0Gy-Ti组在假体周围可见明显的Ti颗粒附着，而且在Ti颗粒周围可见明显矿化的纤维组织，同时假体周围可见纤维膜的形成。0.5Gy-NS组与0Gy-NS组相比较，未见明显的异常，但0.5Gy-Ti组与0Gy-Ti组相比，发现虽然假体周围也存在Ti颗粒并可见骨吸收，但是假体周围的炎性假膜的厚度明显变薄。荧光双标结果显示，0.5Gy-NS组与0Gy-NS组相比，两条荧光标记带的间距明显增宽，差异具有统计学意义；0Gy-Ti与0Gy-NS组相比，差异没有统计学意义。0.5Gy-Ti组与0Gy-Ti组相比，差异没有统计学意义，0.5Gy-Ti组与0.5Gy-NS组相比，新骨形成速率明显下降。对各组标本假体最大拔出力的测试结果显示，0Gy-Ti与0Gy-NS组相比，差异没有统计学意义；0.5Gy-NS组与0Gy-NS组相比，假体的最大压出力显著升高，差异具有统计学意义（p<0.05）；0.5Gy-Ti组与0Gy-Ti组相比，差异没有统计学意义。
　　结论：LDI可有效通过促进骨形成增加假体周围骨长入，提高假体的力学性能。体内的Ti颗粒将显著抵消LDI的促成骨作用但LDI可有效的抑制Ti颗粒引起的假体周围炎症反应。

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声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

参考文献

第一部分 Ti颗粒对成骨样细胞MC3T3-E1的毒性试验

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 低剂量X线照射对Ti颗粒刺激后MC3T3-E1细胞的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 低剂量X线照射与Ti颗粒对兔股骨远端植入假体骨整合的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

综述一:磨损颗粒致无菌性假体松动的研究进展

综述二:LDI促成骨作用及抑制炎症效应的研究进展

英文缩写词释表

攻读博士学位期间公开发表的论文

致谢