miR-34a对树突状细胞发育和功能的影响及机制研究

摘要

microRNAs(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸,参与基因转录后水平调控的非编码小分子 RNA。近年来研究发现,miRNAs参与了众多的生物学过程,如细胞的增殖分化和凋亡、个体发育和疾病的发生发展。现有的研究表明MiRNAs同样参与了免疫系统的各种细胞的分化发育。为进一步探讨 miRNAs在淋巴细胞发育和活化中的作用,通过建立 miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a转基因小鼠模型来进一步研究 miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用。
　　本研究通过q-PCR和流式分析鉴定miR-34a过表达的质粒pMDH-PGK-GFP-miR-34a能成功表达miR-34a。在此基础上,为更好的研究miR-34a对淋巴细胞发育的影响,我们一方面通过制备 miR-34a的逆转录病毒,感染骨髓干细胞,并建立 miR-34a过表达嵌合小鼠模型,通过FACS和PCR检测证明我们的嵌合小鼠模型成功建立。另一方面,为得到更好的稳定的研究模型,我们将pMDH-PGK-GFP-miR-34a用HindIII酶切线性化,并应用显微注射受精卵细胞制备 miR-34a转基因小鼠模型。进一步通过FACS分析发现:无论在嵌合小鼠中,还是在转基因小鼠模型中,我们均发现过表达miR-34a后,其T细胞亚群的比例和其在正常小鼠中发育无显著差异。但我们发现在过表达嵌合小鼠和转基因小鼠中,无论是在骨髓还是在外周的脾脏中,均出现B细胞的显著减少,这个结果和已发表文章结果一致,说明转基因动物模型建立成功。进一步研究发现过表达 miR-34a后,无论是在嵌合模型还是在转基因模型中,树突状细胞(DC)及其各亚群细胞(pDC, cDC)都显著高于其在正常小鼠体内的比例。为了研究miR-34a是如何促进DC的发育,进一步的实验结果显示miR-34a并不影响DC细胞的自我更新和凋亡,而是通过促进pre-DC向pDC和cDC发育来实现的。最后,我们通过软件分析和 PCR、荧光素酶素报告系统等预测和验证miR-34a在DC发育促进中的作用机制,初步发现,miR-34a可能通过作用于多种基因如E2F2、WNT1等来调控DC的发育。通过在转基因骨髓细胞中过表达WNT1,并构建WNT1和miR-34a的嵌合小鼠我们发现WNT1能够逆转由于过表达miR-34a导致的DC增多。这提示,WNT1是miR-34a的功能性靶基因。
　　本文通过体外共培养cDC和na?ve CD4 T细胞发现,过表达miR-34a的cDC抑制了T细胞的增值。用同样的方法我们发现miR-34a并不影响pDC对T细胞应答。进一步表明miR-34a不是通过影响cDC的抗原提呈和自身成熟来影响T的活化增殖。用实时定量PCR检测发现miR-34a的cDC的IL-17a的水平远远高于其在正常cDC的表达。这提示miR-34a cDC对CD4 T细胞的增殖抑制作用可能是通过IL-17a发挥作用的。为了验证是否确实是由于IL-17a导致的这种抑制作用,我们中和抗体中和共培养体系中的IL-17a,结果表明,中和IL-17a能明显消除这种抑制作用。同样我们在cDC与CD4 T细胞共培养体系中加入IL-17a,发现IL-17a能够明显的抑制T细胞的增殖。但单独将IL-17a加入抗CD3、CD28活化的T细胞中却不能抑制T细胞的活化。且流式结果表明IL-17a受体高表达在DC细胞表面。提示 IL-17a直接作用于 DC。有文献报道,WNT1信号下游的一个接头蛋白TCF1对IL-17a的表达有抑制作用,而TCF1有能够抑制一个与IL-17a表达关键的转录因子RORγt的表达,所以我们检测了这两种关键分子是否在这个过程中发挥作用,定量PCR表明TCF1在miR-34a cDC的表达明显下调,而RORγt在cDC的表达明显上调。这提示miR-34a可能通过影响WNT1介导的信号影响了DC产生IL-17a,从而影响DC对T细胞的活化。总结现有研究,我们成功建立了miR-34a过表达嵌合小鼠和转基因小鼠动物模型,为进一步研究 miR-34a的生物学功能提供强有力的研究工具。免疫表型结果提示miR-34a主要促进了pre-DC向pDC, cDC细胞的发育。miR-34a可能通过影响 WNT1基因翻译和稳定来调控 DC的发育。同时 miR-34a通过对WNT1-TCF1-RORγT信号通路调控IL-17a表达,从而影响CD4 T细胞的活化增殖。这为阐明DC发育的分子调控提供了新的理论解释,也首次提出DC通过产生高水平的IL-17调控T细胞免疫应答,为免疫应答的调控提出新的理论。

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前言

第一部分 miR-34a小鼠骨髓嵌合模型与转基因模型的建立

一、材料方法

三、实验结果

三、讨论

第二部分 miR-34a骨髓嵌合小鼠和转基因动物模型的表型分析

一、材料方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 miR-34a促进DC分化发育的功能靶基因分析验证

一、材料方法

二、结果

三、讨论

第四部分 miR-34a对DC功能影响的研究

一、材料方法

二、实验结果

三、讨论

结论

参考文献

综述

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