紫外辐射和水杨酸浸渍对离体桑树枝条韧皮部中桑皮苷A水平的影响

摘要

本实验以桑树栽培品种842(Octoploid variety,即八倍体桑品种)的桑树枝条韧皮部(简称桑枝皮)为实验材料,先采用醇-水提取,后经过大孔树脂(D101)、葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)的吸附与分离进一步提纯,再利用半制备HPLC-DAD技术提取出主要活性单体成分,经过高效液相色谱二极管阵列(HPLC-DAD)检测和与标准品紫外光谱比对分析,最后鉴定分离到的高纯单体为桑皮苷A(mulberroside A)。以制备的桑皮苷A绘制线性方程定量分析待测样品中桑皮苷A的含量,线性方程为y=7535.64716+1508590x,相关系数R2=0.997。因此,在0.1-2.0μg范围内桑皮苷A浓度与其吸光度具有很好的线性关系。本文以此HPLC-DAD检测技术为基础,对紫外辐射和水杨酸处理对离体桑枝条皮层中桑皮苷 A的水平变化进行了系统分析。主要研究内容包括：
　　⑴对桑皮苷A的毒性进行了动物实验。用桑皮苷A处理正常ICR小鼠,采用尾静脉每天注射的方式,研究了桑皮苷 A对小鼠生长与发育的影响。动物实验表明,桑皮苷A处理(50mg/kg)后,样品处理组小鼠体重增加减缓,肝脏系数增大,但统计分析表明与正常对照组的差异不显著;而样品处理组小鼠血清中SOD和GSH-PX水平均有所上升,与正常组没有显著差异;肝脏中SOD和GSH-PX水平均略有下降,但与正常组的差异不显著;而样品处理组小鼠血清与肝脏中总蛋白含量明显增高,统计分析表明与正常组差异显著,但是仍在正常波动范围内;观察肝脏HE染色切片,发现桑皮苷A处理后肝脏细胞出现轻微损伤。综合以上结果显示,桑皮苷 A对体重的增长和肝脏系数无明显影响;对血液和肝组织中各项氧化指标无明显影响,但是对肝脏细胞有轻微损伤作用。
　　⑵我国蚕区每年会产生大量的桑枝,研究这些废弃桑枝的活性成分及其高效利用具有重要的现实意义。桑皮苷 A是一种氧化白藜芦醇二糖苷,是一种桑树的次生代谢产物,在桑根和桑枝中都存在,具有多种生物活性和药理作用。为了研究提高离体桑枝中桑皮苷 A含量的方法,并且保证实验的准确性,所以以桑树栽培品种842的桑枝为试验材料,选用相同位置的枝条,分别用紫外线辐射和水杨酸进行处理。
　　⑶用三种不同波长范围的紫外线(紫外ultraviolet C(UVC)、ultraviolet B(UVB)、ultraviolet A(UVA))对刚剪下来的新鲜842桑枝条进行辐射处理。结果显示,用UVC辐射处理8分钟时,桑皮苷A的含量达到最大(0.72μg/mg),达到处理前的2.2倍;用UVB处理仅2分钟后,桑皮苷A的含量最大(0.61μg/mg),达到处理前的2.7倍;而用UVA处理6分钟时,桑皮苷A的含量达到最大(0.48μg/mg),达到处理前的1.2倍。这些结果表明,三种紫外光辐射都能明显刺激桑枝皮层的细胞,促使皮层细胞分泌桑皮苷A增加。其中紫外波长290-320nm范围的UVB辐射处理对桑皮苷A含量增加的效果最显著。
　　⑷分别以不同浓度的水杨酸浸泡不同时间对刚剪下来的新鲜842桑枝条进行处理。当在60μg/mL浓度的水杨酸中浸泡80s,其桑皮苷A含量升高最快(0.64μg/mg),达到处理前的2.1倍。当缩短浸泡时间(20s)和提高浓度(80μg/mL)同样可以提高桑皮苷 A的含量2.0倍(0.62μg/mg)。这说明水杨酸处理对桑枝皮层的细胞也有显著的刺激作用,从而促使皮层细胞分泌桑皮苷A增多。
　　⑸同一根枝条上下不同部位皮层中桑皮苷A的含量差异非常明显,枝条顶部嫩皮层含量很低(0.14μg/mg),越到下部含量越高,含量高达15倍。桑枝条剪伐的时期对紫外辐射和水杨酸处理的效果也有很大的影响,剪伐的时期越晚,桑树枝条生长时间延长,其韧皮部细胞对处理条件的敏感性变得越差,因而刺激细胞合成桑皮苷A的速度变得越慢。
　　⑹利用HPLC-DAD技术建立了一套完整的桑枝皮中桑皮苷A的分离、纯化、鉴定和快速分析检测的方法,为大量废弃桑枝中桑皮苷 A的医用开发提供了良好的检测手段。动物毒性试验表明桑皮苷 A不会影响正常小鼠生长与发育,对小鼠没有毒性作用。紫外辐射和水杨酸浸渍均能激活离体桑枝皮层细胞,促进桑皮苷A合成。这些试验方法和实验结果为今后桑枝皮中桑皮苷A的分离与高级保健品或生物药物的开发奠定了良好的基础,为促进桑枝生物资源的高效和充分利用作出有益的尝试。

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前言

第一章 文献综述

1.1 概述

1.2分子结构

1.3分离纯化与检测方法

1.4 桑树体内的分布与品种间差异

1.5 药理作用

1.6 药物代谢

1.7 生物合成

1.8 研究的内容和意义

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.2实验设计和方法

第三章 结果分析与讨论

3.1 桑枝皮中桑皮苷A的分离、鉴定及定量分析

3.2桑皮苷A对正常ICR小鼠生长发育的影响

3.3桑树枝条中桑皮苷A的分布

3.4 紫外辐射对桑枝皮中桑皮苷A含量的影响

3.5 水杨酸浸渍对桑枝皮中桑皮苷A含量的影响

3.6紫外辐射对不同剪伐时期桑枝皮中桑皮苷A含量的影响

3.7 水杨酸浸渍对不同剪伐时期桑枝条中桑皮苷A含量的影响

3.8 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间公开发表的论文

基金资助

致谢