胃癌CD40+MDSC亚群的鉴定及生物学功能初步分析

摘要

目的：Gr-1+CD11b+髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)是肿瘤微环境中重要的免疫抑制细胞,其在肿瘤免疫逃逸中发挥着关键作用。因MDSC具异质性,生物学作用复杂,限制了研究者们对MDSC全面深入的了解,因此鉴定MDSC细胞亚群是探讨该群细胞生物学功能的重要前提。本研究拟鉴定MDSC亚群并探讨其生物学功能,为胃癌免疫干预治疗提供新的策略。
　　方法：肿瘤细胞系皮下种植构建C57BL/6小鼠荷瘤模型;流式细胞术动态检测荷瘤小鼠脾脏和肿瘤组织浸润MDSC的累积水平及其表面CD40的表达水平。体外功能实验中,以CD40激发型抗体刺激MDSC培养24hr后,以Gr-1抗体、CD11b抗体、Annexin V标记,流式分析CD40信号对MDSC凋亡的影响率。采用流式细胞分选技术从胃癌荷瘤小鼠脾脏细胞中分选出CD40+和CD40-Gr-1+CD11b+MDSC,细胞甩片技术离心涂片后,以Wright染色观察两亚群细胞形态;基因芯片技术筛选两亚群关键差异性分子及信号通路的差异性,并以实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)进一步确认基因芯片结果。
　　结果：(1)本实验发现荷瘤小鼠MDSC表达CD40分子,且表达水平高于正常小鼠。在胃癌模型中,随着肿瘤的生长荷瘤小鼠脾脏与肿瘤组织中MDSC的累积水平逐渐升高,而MDSC表面CD40的表达则逐渐降低,呈现负相关。皮尔森相关系数(Pearson’s Correlation)显示:脾脏及肿瘤组织中MDSC的累积水平均与肿瘤进展呈正相关(脾脏:r=0.9318,p<0.0001;肿瘤:r=0.9169,p<0.0001);MDSC表面CD40的表达水平与其累积水平呈负相关(脾脏:r=-0.8690,p=0.0002;肿瘤:r=-0.8673, p=0.0003)。凋亡检测发现CD40激发型抗体能诱导MDSC凋亡,其中肿瘤组织浸润MDSC的凋亡率(mean±SEM,％)由71.37±2.68被诱导至79.09±3.29,差异具统计学意义(p=0.0352);脾脏来源的MDSC凋亡率(mean±SEM,％)由25.43±10.45诱导至32.30±10.27,差异具统计学意义(p=0.0167)。(2)胃癌荷瘤小鼠脾脏中Gr-1+CD11b+MDSC以CD40为标记分子可分为两个亚群:CD40-MDSC和CD40+MDSC。形态学显示CD40-MDSC以环形核、分叶核和多形核幼稚的粒细胞为主,核质比较大。CD40+MDSC多为圆形和椭圆形核,核质比较大,主要是幼稚单核细胞。实时荧光定量PCR提示与CD40-MDSC比较,CD40+MDSC分泌TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10、IL-1β、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)及精氨酸酶(arginase,Arg)水平增高,其中以PGE2(Foldchange=7.29)及Arg(Foldchange=3.12)的上调具有统计学意义(Foldchange≥2.0)。除此之外,这两群细胞一些重要免疫抑制表型及免疫趋化迁移分子的表达也具有广泛差异,如CD83、FMS样的酪氨酸激3(fms-like tyrosine kinase,FLT3)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、CXC趋化因子受体5(CXCR5)和CXC趋化因子配体9(CXCL9)在CD40+MDSC均显著高于CD40-MDSC(Foldchange≥2.0)。
　　结论：(1)荷瘤小鼠MDSC表面表达CD40分子,且其表达水平高于健康小鼠;然而在胃癌模型中CD40表达水平随着肿瘤进展逐渐降低,与MDSC的累积水平呈负相关;CD40可诱导MDSC的凋亡,MDSC表面CD40的下调诱导了MDSC的抗凋亡,可能是参与调节MDSC累积的机制之一。提示在肿瘤早期,MDSC上CD40诱导表达可以促进炎症性反应,营造适合胃癌生长的炎性环境;随着肿瘤进展CD40不断降低,CD40介导MDSC凋亡的作用逐渐减弱,导致MDSC逐渐累积,营造胃癌生长的免疫学豁免环境。(2)CD40分子可作为鉴定胃癌MDSC两亚群的表面标记物,在表型和功能分子尚存在较大差异,提示两类亚群的生物学功能各不相同,在促进胃癌进展中可能发挥了截然不同的功能。

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前言

1. MDSC的起源与定义

2. MDSC的异质性及其分群

3. MDSC的扩增及激活

4. MDSC的免疫抑制机制

5. CD40与MDSC

第一部分 CD40表达水平参与调节MDSC的累积

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 胃癌CD40+MDSC亚群的鉴定及生物学功能初步分析

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论与展望

综述

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