中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性研究

摘要

疟疾是全球最重要的寄生虫病之一，媒介防制是疟疾控制和消除阶段的最有效的技术措施之一。目前媒介防制中应用最为广泛的是化学防治的方法，而化学防治中主要依靠杀虫剂的成蚊控制措施。拟除虫菊酯类杀虫剂由于其高效、低毒、经济等优点，不仅已成为疟疾媒介防制措施中杀虫剂室内滞留喷洒（IRS）、杀虫剂浸泡蚊帐(ITN)和杀虫剂处理长效蚊帐(LLIN)的首选杀虫剂，而且在其他公共卫生领域也被广泛使用。同时，拟除虫菊酯类杀虫剂也是农业领域应用最广泛的杀虫剂。然而随着杀虫剂的长期和广泛使用，杀虫剂抗性在全球迅速蔓延，目前按蚊几乎对所有种类的杀虫剂都有抗性报道。
　　除加快新型杀虫剂或杀虫剂新剂型研发外，延缓杀虫剂抗性的发展和扩散也是最经济、有效的方法之一。而对杀虫剂抗性机制的了解是我们正确、有效地选择和使用杀虫剂，从而能延缓杀虫剂抗性的发展和扩散的基础。
　　本研究以目前国内分布最为广泛的传疟媒介-中华按蚊为研究对象，通过现场采集野外中华按蚊样本，检测其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平和击倒抗性(kdr)突变频率;通过实验室选育拟除虫菊酯类杀虫剂抗性中华按蚊和观察现场按蚊在实验室驯化过程中抗性水平和抗性基因突变频率的变化进一步了解其对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性产生的可能机制;通过对中华按蚊拟除虫菊酯类杀虫剂抗性和敏感群体的转录组基因分析、抗性相关基因的分布及聚类特征分析，进行杀虫剂抗性基因的筛选，为今后开展抗性关键因子的鉴定和功能研究奠定基础。
　　第一部分野外中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性水平和kdr突变频率的检测
　　目的:了解现场采集的野外中华按蚊拟对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平和kdr突变频率。
　　方法:分别从江苏省4个地区现场采集4龄期按蚊幼虫或蛹，经形态学和分子鉴定后,对确认为中华按蚊的样本进行实验室饲养，待其羽化为成蚊后3-4天，分别采用世界卫生组织(WHO)推荐的生物接触筒法，测定其对溴氰菊酯杀虫剂的抗性水平;采用本课题组前期建立的AS-PCR的方法，检测不同抗性表型中华按蚊的kdr突变水平和突变频率。
　　结果:4个地区现场采集的中华按蚊接触溴氰菊酯杀虫剂24h后的死亡率均低于10％，远低于死亡率＜90％的WHO判定抗性标准;AS-PCR检测发现野外中华按蚊种群kdr突变频率很高（88.2％-100％）;发现野外捕获中华按蚊种群存在TGT、TTT、TTC3种kdr突变基因型和L1014C和L1014F2种kdr突变型;新发现野外捕获的中华按蚊经实验室驯化饲养1-2年后，不仅杀虫剂抗性水平迅速回落，而且kdr突变也随之消失。
　　第二部分现场中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性群体的选育
　　目的:选育并建立中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性品系;分析抗性群体选育过程中抗性水平和kdr、 P450s、GST等指标的变化，并探讨中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性产生和发展的机理。
　　方法:收集现场饱血按蚊亲代样本，经形态学和分子鉴定确认为中华按蚊后，对其子代3-4日龄所有雌雄成蚊均进行溴氰菊酯杀虫剂逐代选育直至抗性维持在较稳定的水平;同时采用人工强迫交配法以提高按蚊交配率和产卵率;利用新建的AllGlo-qPCR法对逐代杀虫剂抗性选育后的成蚊进行kdr突变水平和突变频率的检测，同时对选育群体进行P450s和GSTs等代谢解毒酶的活性进行检测。
　　结果:现场按蚊在经过2代杀虫剂处理后的选育群体kdr突变频率就达到100％，TTT是其中最主要的突变基因型(L1014F);其抗性水平随着杀虫剂处理每一代稳步上升，但与kdr突变呈现不同步的现象，直至选育到第4代时，雌雄成蚊才对溴氰菊酯杀虫剂产生100％的抗性;选育群体的GSTs和P450s酶活性均明显高于实验室敏感蚊。
　　第三部分转录组测序（RNA-seq）用于中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性基因筛选的研究
　　目的:建立中华按蚊种群EST数据库;筛选中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关基因，为系统进行杀虫剂抗性机制研究和建立抗性监测方法提供科学依据。
　　方法:分别提取对杀虫剂敏感的中华按蚊实验室模式种发育阶段各期(卵、幼虫、蛹和雌性成蚊）、对溴氰菊酯杀虫剂抗性的现场子一代3-4日龄雌性成蚊、对溴氰菊酯杀虫剂敏感的现场子一代3-4日龄雌性成蚊总RNA，并分别制备4组上机文库;454GSFLX高通量转录组数据经去街头、聚类拼接、功能注释、DEGs等分析，并选取部分基因进行qPCR验证;同时还进行Microsatellite和SNP等分子标记的筛选。
　　结果:聚类拼接共产生33，411个contigs（平均长度为493bp）;共产生8，057个EST，其中大多有GO和KEGG功能注释;发现2，131个中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关基因DEGs，其中选取的部分代谢酶、免疫基因等qPCR验证结果与RNA-seq结果吻合;另外，发现了2，408个Microsatellite和15，496个SNP分子标记位点。
　　结论:
　　1.研究发现江苏省不同地区野外捕获的中华按蚊kdr突变频率很高，野外的中华按蚊kdr突变以L1014F突变型为主，L1014F突变中以TTT突变基因为主，但不同地区的kdr突变类型和突变基因种类存在较大的差异。
　　2.研究发现中华按蚊抗溴氰菊酯杀虫剂抗性群体在失去杀虫剂选择压后，kdr突变消失且其抗性水平显著降低;
　　3.研究建立了中华按抗溴氰菊酯杀虫剂抗性实验室品系，并发现细胞色素P450单加氧酶和GSTs的活性增高也与其溴氰菊酯杀虫剂抗性相关。
　　4.研究采用RNA-seq法构建了中华按蚊转录本数据库，并筛选出一批与中华按蚊杀虫剂抗性相关的ESTs和微卫星、SNPs等分子标记物，为中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性机理的进一步研究提供了新的基础。
　　5、研究结果提示江苏省中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂已产生高度抗性，可通过调整杀虫剂种类和使用方法来延缓中华按蚊对拟除虫菊酯杀虫剂抗性的产生和发展，以消除对实现消除疟疾目标的潜在的威胁。