共刺激分子B7-H3对LPS诱导的急性肺损伤的免疫调节作用及其机制研究

摘要

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）作为一种肺部的炎症性损伤，是临床上较为常见的急危重症之一，具有高致死率和致残率的特点。如何有效预防和治疗ALI是临床上所面临的难题之一。B7-H3作为一个共刺激分子在固有免疫应答和调节中发挥重要的作用，但 B7-H3在ALI中的免疫调节目前知之甚少。本研究通过建立内毒素诱导的小鼠ALI模型，探讨B7-H3在ALI发生发展中的调节作用，进一步阐明B7-H3对ALI的调节机制，以期为临床ALI的免疫治疗提供一个新的靶点。
　　第一部分小鼠急性肺损伤模型的建立
　　目的：建立一种成功率和存活率高的细菌脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型。
　　方法：20只雄性 BALB/c小鼠随机分为脂多糖组（LPS组）和生理盐水对照组。经鼻腔滴注 LPS建立小鼠急性肺损伤模型，记录模型建立的成功率及小鼠的存活率。24h后，收集小鼠的肺组织和肺泡灌洗液（BALF），通过细胞计数和瑞氏染色明确 BALF中的白细胞总数和中性粒细胞的数量，BCA法测定 BALF中总蛋白的含量，ELISA法分析 BALF中炎症因子及趋化因子的蛋白水平变化。实时定量 PCR和 ELISA法分别检测肺组织中炎症因子和趋化因子的mRNA和蛋白水平的变化。肺组织经HE染色于经光学显微镜下观察肺组织病理学改变。
　　结果：HE染色发现 LPS组小鼠肺组织出现不同程度的肺组织充血、微血管内皮损伤出血、炎性渗出、中性粒细胞浸润、肺泡壁增厚和破坏及透明膜形成等急性肺损伤的病理改变，而对照组的小鼠未见上述病理改变；较之于对照组，LPS组小鼠 BALF中总细胞数和中性粒细胞数均显著增加(p<0.01)；与对照组相比，LPS组小鼠BALF中的总蛋白含量、炎症因子及趋化因子水平也发生明显升高(p<0.05)。与对照组相比，LPS组小鼠肺组织中的炎症因子和趋化因子的mRNA和蛋白水平均发生明显升高(p<0.01)。
　　结论：经鼻腔滴注 LPS构建了小鼠急性肺损伤模型，并证实该模型具有较高的成功率和存活率。
　　第二部分共刺激分子B7-H3通过调节中性粒细胞的功能在急性肺损伤中的保护作用
　　目的：通过已建立的小鼠急性肺损伤模型，分析共刺激分子 B7-H3对 LPS诱导的急性肺损伤的调节作用。
　　方法：40只雄性 BALB/c小鼠随机均分为：对照组、B7-H3单独处理组、LPS组和 LPS+B7-H3联合处理组。采用鼻孔滴注 LPS建立小鼠内毒素急性肺损伤模型，建模24h后，收集各实验组小鼠的肺组织和 BALF。各实验组的肺组织经 HE染色后经光学显微镜观察肺组织病理学改变；BCA法测定 BALF中总蛋白的含量；通过细胞计数和瑞氏染色明确 BALF中的白细胞总数和中性粒细胞的数量；通过髓过氧化物酶(MPO)试剂盒检测肺组织 MPO活性；实时定量 PCR和 ELISA法检测肺组织中炎症因子和趋化因子的mRNA和蛋白水平变化；ELISA法测定BALF中炎症因子和趋化因子的蛋白水平变化。
　　结果：HE染色结果发现采用 B7-H3重组蛋白能减轻 LPS诱导 ALI模型肺组织的病理损伤程度、显著降低LPS诱导 ALI模型 BALF中白细胞数、中性粒细胞数和总蛋白的含量以及显著降低 LPS诱导 ALI模型肺组织中 MPO的活性（p<0.05）；B7-H3能降低 BALF和肺组织中趋化因子（CXCL2）的表达，与 LPS相比差异有统计学意义，但不影响BALF中炎症因子TNF-α，IL-1β和IL-6表达的变化。
　　结论：通过ALI模型的研究发现，B7-H3能减轻LPS诱导 ALI模型肺组织的病理损伤程度，降低肺血管的通透性，抑制肺组织 MPO活性，降低趋化因子的表达水平，进而发挥保护作用。
　　第三部分共刺激分子B7-H3通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞趋化对急性肺损伤的保护作用机制
　　目的：探讨共刺激分子 B7-H3对中性粒细胞和肺泡巨噬细胞的调控作用，分析B7-H3在急性肺损伤中的作用机制。
　　方法：40只雄性 BALB/c小鼠随机均分为：对照组、B7-H3单独处理组、LPS组和LPS+B7-H3联合处理组。建立小鼠急性肺损伤模型24h后，收集各实验组小鼠的BALF，流式细胞术检测 BALF中的中性粒细胞凋亡情况。通过胶原酶消化法、贴壁法和磁珠分选获得小鼠肺内皮细胞、肺泡巨噬细胞和骨髓源中性粒细胞。分别在体外对中性粒细胞的凋亡、趋化及跨内皮迁移进行评价。同时采用流式细胞术分析 LPS刺激后中性粒细胞表面 CXCR2和 Mac-1的表达水平；化学发光法检测活性氧（ROS）的生成；实时定量 PCR及 ELISA检测肺泡巨噬细胞中趋化因子 CXCL2的mRNA和蛋白水平；流式细胞术检测肺泡巨噬细胞中NF-kB p65和MAPK p38的磷酸化水平。
　　结果：在体内和体外模型中，B7-H3重组蛋白处理对中性粒细胞凋亡无影响，但能够显著降低LPS刺激后PMN的趋化能力，且PMN表面CXCR2的表达明显下调。B7-H3能够显著降低LPS刺激后PMN的跨内皮细胞迁移能力，且PMN表面Mac-1的表达也明显下调，能够显著抑制LPS刺激后ROS的释放。同时还证实B7-H3能够显著减少LPS刺激后肺泡巨噬细胞中CXCL2的表达，并且会导致NF-kB p65磷酸化水平的下调，但是对MAPK p38的磷酸化水平没有作用。
　　结论： B7-H3重组蛋白不仅影响中性粒细胞的趋化作用、中性粒细胞跨肺内皮单层细胞的迁移作用、中性粒细胞的ROS产生，还影响肺泡巨噬细胞上趋化因子CXCL2的表达以及NF-kB信号通路中p65磷酸化水平。由此可见，B7-H3主要通过抑制中性粒细胞和肺泡巨噬细胞向肺损伤部位趋化，继而减轻肺损伤起到保护作用。

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前言

第一部分 小鼠急性肺损伤模型的建立

材料与方法

结果

讨论

第二部分 共刺激分子B7-H3通过调节中性粒细胞的功能在急性肺损伤中的保护作用

材料和方法

结果

讨论

第三部分 共刺激分子B7-H3通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞趋化对急性肺损伤的保护作用机制

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述:急性呼吸窘迫综合征临床转化医学进展

1. ARDS的机制研究进展

2. ARDS的潜在治疗靶点

结语

参考文献

中英文对照缩略词表

攻读博士期间发表的论文

本研究所获得的基金资助

致谢