血清microRNA对持续丙氨酸氨基转移酶正常慢性乙肝病毒感染者的诊断价值

摘要

我国肝脏疾病中慢性乙肝病毒（HBV）仍是主要病因，由于仍然缺乏根治乙肝病毒药物，目前慢性乙型肝炎治疗的总体目标只能是最大限度地长期抑制 HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、HCC及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。对慢性乙肝治疗适应症的判断需依赖HBV病毒学指标，生化学指标甚至肝组织学检查。
　　丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标，也是各种指南关于慢性乙肝抗病毒治疗和预后判断的重要指标。但近年来，不断有持续ALT正常（persistently normal ALT,PNALT）慢性乙肝病毒感染者伴有明显肝损伤的报道.甚至发展成肝硬化和肝细胞癌的报道。对这类慢性乙肝的特殊群体，由于报道的人群不同，样本量相差大，掌握ALT正常的持续时间不同等原因，结果不一：有的报道认为PNALT人群，肝组织损伤轻2％-3%；有的报道中度以上的肝纤维化比率达49%(42/85)。对PNALT这个特殊人群，各种慢性乙肝防治指南均建议严密观察和肝穿刺组织学检查，但肝穿刺的有创性，标本的局限性以及病理医生的主观差异性等问题，决定了肝穿刺难以被患者普遍接受，发展新的无创诊断技术以及寻找新的生物诊断标志物一直是研究的热点。
　　我们自2006年来长期关注PNALT慢性乙肝病毒感染者这一群体，积累的病例及生物标本在2000例以上。本研究采用回顾前瞻性研究，试图阐述以下问题：
　　一、PNALT慢性乙肝感染者的临床特点和病理特点，其影响因素？
　　二、除了病理诊断目前常用的无创性肝纤维化指标（技术）对 PNALT慢性乙肝的诊断效应如何？
　　三、血清miRNA具有生物标志物特性，在显著肝组织损伤的PNALT与不显著肝组织损伤PNALT之间是否存在差异表达的miRNA?
　　四、如果存在差异的miRNA表达，可否进一步筛选出用于诊断的miRNA组合？
　　第一部分持续丙氨酸氨基转移酶正常的慢性乙型肝炎病毒感染者的临床、肝脏病理学特点及相关因素分析
　　目的:了解持续丙氨酸氨基转移酶正常（PNALT）的慢性乙肝感染者的临床及肝脏病理学特点。
　　方法:采用回顾-前瞻性连续观察我院2006年8月至2013年12月的所有进行过肝穿刺病理学检查的慢性乙肝感染者，共入选2467例进行过肝穿刺慢性乙肝病例，排除1210例。PNALT共589例，其中HBeAg阳性228例，HBeAg阴性，361例；持续丙氨酸氨基转移酶间断正常（PIALT1）(ALT1-2ULN,n=386)，其中HBeAg阳性187例，HBeAg阴性，199例；PIALT2(ALT>2ULN,n=282)，其中HBeAg阳性156例，HBeAg阴性，126例。肝组织标本行苏木精--伊红染色、纤维Masson染色等染色，进行Knodell坏死炎症评分和Ishak纤维化评分。Logistic回归分析相关危险因素，受试者工作曲线下面积（the area of receiver operating characteristic(ROC) curve,AUC）评价相应因素的诊断价值。
　　结果: HBeAg阳性 PNALT,PIALT1和 PIALT2中度以上炎症坏死比率分别为16.23%（37/228）,26.74%(50/187)和30.13%（47/156）;中度以上肝纤维化比率分别为14.47%（33/228）,22.46%(42/187)和23.72%（37/156）; HBeAg阴性PNALT,PIALT1和PIALT2中度以上炎症坏死比率分别为13.30%（48/361）,22.11%(44/199)和24.60%（31/126）;中度以上肝纤维化比率分别为16.62%（60/361）,23.62%(47/199)和25.40%（32/126）。将ALT正常与否视为二分类变量，Logistic回归分析HBeAg阳性慢性乙肝感染者发现HBV DNA高载量，AST以及年龄40~60岁是ALT异常的独立危险因素；Logistic回归分析HBeAg阴性慢性乙肝感染者发现AST以及年龄40~60岁是ALT异常的独立危险因素。将显著性炎症坏死和显著性肝纤维化分别与非显著性病理损伤视为二分类变量，Logistic回归分析HBeAg阳性PNALT发现无相关独立危险因素与显著性肝病理损伤有关；同样方法发现HBeAg阴性PNALT发现年龄40~60岁是显著性肝纤维化的独立危险因素。使用ROC观察AUC发现ALT在对PIALT与PNALT的诊断价值上，对显著性炎症坏死有一定的诊断价值而无论E抗原状态，但只对E抗原阴性慢性乙肝肝纤维化有一定诊断价值。但如单一针对PNALT患者在肝组织病理损伤上无诊断价值。
　　结论:大样本连续性观察了PNALT和 PIALT慢性乙肝感染者的临床和肝组织病理学特点，发现ALT在对PIALT与PNALT的诊断价值上仍一定程度反映了肝组织学的损伤程度，但对PNALT人群无肝组织学的损伤诊断价值。
　　第二部分无创肝纤维化诊断技术在PNALT慢性乙肝感染者中的应用
　　目的:ALT难以区别PNALT慢性乙肝感染者，了解无创肝纤维化诊断技术在PNALT慢性乙肝感染者中的诊断效应
　　方法:研究采用回顾前瞻性研究，病例来自于我院2013年8月至2014年10月所有的慢性乙肝感染者进行肝穿刺病理检查并进行过 FibroScan检测的患者，病例包含第一部分中部分和新入组病人，共入选245例，PNALT共95例，其中HBeAg阳性45例，HBeAg阴性，50例；PIALT(ALT1-2ULN,n=86)，其中HBeAg阳性36例，HBeAg阴性，50例；PIALT(ALT≥2ULN,n=64)，其中HBeAg阳性26例，HBeAg阴性，38例。使用APRI（aspartate aminotransferase to platelet ratio index），FIB-4(fibrosis-4)以及瞬间肝脏弹性测定（transient elastography）对上述病人进行测定，使用受试者工作曲线下面积（AUC）评价这三种无创肝纤维化指标或技术的诊断效应。
　　结果:APRI的检测值在PNALT,PIALT1，PIALT2分别为0.32±0.14，0.61±0.44，1.25±0.62（F=284.92,P<0.001）;FIB-4在各组分别为0.72±0.36，1.12±0.53，1.67±0.84，（F=56.37，P<0.001） FibroScan检测值LSM(KPa)为5.33±2.45，7.36±3.14，10.22±5.53（F=46.34,P<0.001）。PNALT,PIALT1和PIALT2中度以上炎症坏死比率分别为16.81%（16/95）,32.56%(28/86)和45.31%（28/64）;中度以上肝纤维化比率分别为23.96%（23/95）,33.72%(29/86)和43.75%（28/64）;PIALT组炎症坏死还是肝纤维化程度均较PNALT组严重（P均<0.05）。APRI对PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分别为0.518（截断值0.202，P=0.7852）；0.659（截断值0.524，P=0.011）；0.735（截断值1.26，P<0.001）;0.65（截断值1.15，P<0.001）。FIB-4对PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分别为0.597（截断值0.698，P=0.152）；0.642（截断值1.174，P=0.021）；0.667（截断值1.46，P=0.015）;0.659（截断值0.96，P<0.001）。Fibroscan对PNALT，PNALT1，PNALT2和所有病人的AUC分别为0.769（截断值7.3，P<0.001）；0.8（截断值7.5，P<0.001）；0.708（截断值8.5，P=0.017）;0.763（截断值7.5，P<0.001）。三种无创性肝纤维化指标的诊断价值比较发现，在PNALT组LSM比较APRI和 FIB-4曲线下面积差均有统计学意义（P均<0.05）；在PIALT1组，无论APRI比较FIB-4，还是LSM比较APRI和 FIB-4曲线下面积差均无统计学意义（P均>0.05）；同样地，在PIALT2组，无论APRI比较FIB-4，还是LSM比较APRI和 FIB-4曲线下面积差也均无统计学意义（P均>0.05）；对总体病人的比较，可以看到，仅有LSM比较APRI曲线下面积差有统计学意义（P<0.05），APRI比较FIB-4或者LSM比较FIB-4均无统计学意义（P均>0.05）。
　　结论:常用的血清学肝纤维化诊断指标APRI和 FIB-4，对PNALT慢性乙肝感染者不是理想的诊断模型，APRI和FIB-4根据常用的血液生化指标建立，更适合ALT异常的慢性乙肝。而Fibroscan是通过测定肝脏硬度来判断肝纤维化程度，由于受肝脏炎症坏死的影响较大，虽然对无论 ALT增高与否均有较好的诊断效应，但对ALT正常慢性乙肝其诊断效应更高。
　　第三部分深度测序分析显著肝组织损伤的PNALT慢性乙肝感染者的差异microRNA血清表达
　　目的:使用新一代深度测序检测显著肝组织学损伤的PNALT慢性乙肝感染者的血清miRNA的差异表达
　　方法:使用Illumina Hisque2000对6例显著肝组织学损伤（中度以上的炎症坏死或者中度以上的肝纤维化）的PNALT慢性乙肝（SPNALT）,6例无显著肝组织学损伤（轻度及以下的炎症坏死或者轻度及以下的肝纤维化）的PNALT慢性乙肝（NSPNALT）和6例正常健康人（healthy control），操作步骤按照公司提供的流程进行，所有Illumina Hisque2000测序数据转换为Log2，三组样品间的两两比较使用卡方（chi-square）和精确概率法（fisher exact test）处理。筛选条件是倍数差异2倍以上和P<0.01。
　　结果:三组混合样本（健康对照，NSPNALT和SPNALT）的Illumina Hisque2000测序的小RNA共分别产生7,896,608,8,580,434和7,485,507个 raw-reads,经过进一步处理和质量控制，raw-reads减少到494,523,659,447和441,182 clean reads。miRNA长度集中分布在20~24nt，总共有2767个独一的reads和人类miRNAs或者pre-miRNAs吻合。从SPNALT与健康对照比较，可以看出有143个miRNA有显著性差异表达，其中有22个miRNAs4倍上调，且P<0.01，有4个miRNAs4倍下调，且P<0.01；从SPNALT与NSPNALT比较，可以看出有88个miRNA有显著性差异表达，其中有13个miRNAs4倍上调，且P<0.01，有21个miRNAs4倍下调，且P<0.01。
　　结论: Illumina Hisque2000测序，发现了SPNALT与NSPNALT和健康对照组之间存在血清miRNA的差异表达，结果已经被GEO(Gene Expression Omnibus)收录，收录号为G62290.
　　第四部分血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的诊断价值
　　目的:miRNA具有良好的生物标记物特性，它们定义明确、化学结构一致、便于物种化管理以及在细胞和循环中均稳定表达。通过筛选验证发现血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的诊断价值。
　　方法:创造性地运用“四步筛选法”筛选上部分在发现阶段采用新一代深度测序技术（Illumina Hiseq2000）发现的差异血清miRNA，再通过筛选阶段，使用qRT-PCR的方法，选定内参miRNA，建立均一的少量队列筛选集（健康对照20例，NSPNALT20例，SPNALT20例），筛选出miRNA Ct value<35和detection rate>75%;p<0.05的miRNA。筛选出候选miRNA后，进入训练阶段（健康对照62例，NSPNALT72例，SPNALT65例），使用qRT-PCR对大样本训练集检验目的miRNA，并使用LogiticP建立miRNA模型。最后是验证阶段（健康对照40例，NSPNALT55例，SPNALT53例），利用训练集建立的miRNA模型，对独立建立的队列验证集进行验证，评价其诊断价值。
　　结果: SPNALT vs总对照训练出候选miRNA7个，分别是hsa-miR-885-5p，hsa-miR-10a-5p，hsa-miR-511-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-98-5p，hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-30b-5p; SPNALT vs Healthy训练出候选miRNA6个，分别是hsa-miR-885-5p，hsa-miR-122-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-192-5p hsa-miR-30b-5p; SPNALT vs NSPNALT训练出候选miRNA5个, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-511-5p, hsa-miR-98-5p, hsa-miR-30b-5p。SPNALT区别健康对照组的LogisticP1=-4.0262-0.28851XmiR_122-0.50803X miR_885+0.85701X miR_26a；SPNALT区别 NSPNALT组的LogisticP2=-43.5606+0.84629X miR_122+0.67945X miR_30b-0.29171X miR_511+0.56001X miR_98； SPNALT区别总对照组的LogisticP3=-15.5745-0.38122X miR_10a+0.27707X miR_30b-0.33520X miR_885+0.88670X miR_98。SPNALT区别总对照组miRNA panel3的诊断价值:AUC=0.826(95%CI=0.775–0.878，sensitivity=70.8%, specificity=83.4%, p<0.01)；SPNALT区别健康组miRNA panel1的诊断价值:AUC=0.836;95%CI,0.775~0.897，sensitivity78.7%,specificity83.3%, p<0.01);SPNALT区别NSPNALT组miRNA panel2的诊断价值:AUC=0.864，95%CI,0.813~0.916，sensitivity79.6%, specificity84.7%，p<0.01)。
　　结论:我们利用四步筛选法发现了可以区别于健康对照和无显著肝组织损伤的PNALT的血清miRNA panels.
　　创新点：
　　1、大样本、连续回顾前瞻性的研究了PNALT慢性乙肝的临床和病理学特点并分析影响因素；
　　2、评价了常用的血清肝纤维化模型以及FibroScan无创性肝纤维化技术对PNALT这一人群的诊断价值；
　　3、创造性应用“四步筛选法”发现了miRNA可以区别肝组织损伤明显的PNALT慢性乙肝感染者。

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声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

参考文献

第一部分持续丙氨酸氨基转移酶正常的慢性乙型肝炎病毒感染者的临床、肝脏病理学特点及相关因素分析

1.1 前言

1.2 病例与方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结与展望

1.6 参考文献

第二部分无创肝纤维化诊断技术在PNALT慢性乙肝感染者中的应用

2.1前言

2.2病例与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结与展望

2.6 参考文献

第三部分深度测序分析显著肝组织损伤的PNALT慢性乙肝感染者的差异microRNA血清表达

3.1前言

3.2病例与方法

3.3统计学处理

3.4结果

3.5 讨论

3.6 小结与展望

3.7 参考文献

第四部分血清miRNA在SPNALT慢性乙肝感染者的诊断价值

4.1前言

4.2 研究设计

4.3 实验方法

4.4 结果

4.5 讨论

4.6 小结与展望

4.7 参考文献

第五部分文献综述 miRNA与肝脏疾病

5.1 miRNA在肝脏疾病

5.2 已用于研究miRNA和HBV的相互作用的模型系统

5.3 用于分析miRNA的表达的方法

5.4和HBV相关的miRNA

5.6 酒精性肝病和非酒精性肝病

5.7 急性肝衰竭

5.8 肝纤维化

5.9 原发性肝细胞癌

5.5 肝细胞类型及相关的miRNA

5.6 生物标志

5.7 治疗

5.8 临床研究进展

5.9 研究方向

5.10 参考文献

第六部分总结与展望

6.1 结果与结论

6.2 不足与展望

6.3 参考文献

附录

附表1 RT primer

附表2 使用数据库信息

中英文缩写

就读博士期间取得的科研成果

8.1取得的科研奖项

8.2发表的学术论文

8.3 完成的科研

致谢