构建预存HLA-A2抗体动物模型并探索有效干预措施

摘要

肾脏移植是终末期肾脏疾病最好的治疗方法。随着免疫抑制药物广泛使用，T细胞介导排斥反应显著降低，但是急、慢性抗体介导排斥反应在肾脏移植物丢失中起着越来越重要作用。预存或术后新生抗人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）抗体介导的排斥反应已被认为是影响移植物长期存活的最重要因素。因此如何有效清除抗HLA抗体及抑制抗体介导的排斥反应已经成为研究和临床治疗的热点。
　　本研究通过体外合成人源化HLA-A2蛋白，用其构建预存抗HLA-A2抗体动物模型并探索有效干预措施，为临床脱敏治疗奠定基础。本文共分为三部分：
　　第一部分应用原核表达系统制备人源化HLA-A2重组蛋白
　　目的：应用原核表达系统合成人源化HLA-A2胞外段蛋白。
　　方法：利用PCR（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术从THP-1细胞中扩增HLA-A2胞外结构域基因，并将其连接至PMD19-T载体，构建形成PMD-19-HLA-A2克隆载体，通过克隆鉴定和测序分析，利用PCR技术从PMD-19-HLA-A2中扩增HLA-A2胞外段基因，并将其插入pCzn1载体，构建形成pCzn1-HLA-A2表达载体，通过克隆鉴定和测序分析后，将其转化到原核表达细胞中进行目的蛋白表达、纯化和鉴定。
　　结果：经过克隆鉴定和测序鉴定，PMD-19-HLA-A2克隆载体和pCzn1-HLA-A2表达载体构建成功；诱导表达后所获取蛋白溶液，经过镍柱亲和层析纯化后，获得HLA-A2重组蛋白，浓度约为0.49 mg/mL。纯化后HLA-A2重组蛋白经考马斯亮蓝染色鉴定，可见一条分子量约为34kD的特异性条带，与目的蛋白大小相符。
　　结论：应用原核表达系统可成功表达人源化HLA-A2重组蛋白，为下一步建立预存抗体动物模型奠定物质基础。
　　第二部分应用 HLA-A2重组蛋白建立预存 HLA-A2抗体的BALb/c小鼠模型
　　目的：探讨预存HLA-A2抗体小鼠模型所需免疫原剂量及免疫后小鼠体内抗体和淋巴细胞的变化，为探索治疗方案奠定基础。
　　方法：运用不同剂量的HLA-A2重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀后行腹部皮下免疫，使用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测法和流式细胞检测法观察不同时间点小鼠外周血HLA-A2抗体的变化及小鼠骨髓和脾脏中淋巴细胞、CD138+浆细胞及C19+B细胞和各B细胞亚群变化。
　　结果：200μg和100μg免疫剂量均引起小鼠外周血抗体滴度显著增加，但两者之间差异没有统计学意义。免疫后，小鼠脾脏中淋巴细胞、CD138+浆细胞及C19+B细胞比例逐渐升高，于第4周时达到顶峰；骨髓中淋巴细胞、CD138+浆细胞及C19+B细胞比例逐渐升高，于第2周时达到顶峰；骨髓和脾脏中分别以前/祖 B细胞及记忆性B细胞亚群变化最明显。
　　结论：100μg作为免疫剂量于4周时可以有效建立预存HLA-A2抗体BALb/c小鼠模型，并成功观察到免疫后小鼠骨髓和脾脏中淋巴细胞亚群变化规律，为下一步探索清除预存抗体奠定理论基础。
　　第三部分清除高致敏小鼠体内预存HLA-A2抗体的研究
　　目的：研究不同治疗方法对预存HLA-A2抗体的BALb/c小鼠外周血中抗体及脾脏和骨髓中淋巴细胞的影响。
　　方法：运用已构建预存HLA-A2抗体的BALb/c小鼠模型，分别使用ELISA法和流式细胞仪检测药物治疗后小鼠外周血中HLA-A2抗体及脾脏、骨髓中淋巴细胞亚群的变化；采用磁珠分选小鼠脾脏和骨髓中CD138+浆细胞，并运用实时定量PCR(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, Real Time PCR)技术检测硼替佐咪治疗后CD138+浆细胞的相关因子相对表达量变化。
　　结果：硼替佐咪单剂量治疗后，骨髓中CD19+B细胞和CD138+浆细胞显著下降，其以CD138+浆细胞最明显，且骨髓中前/祖B细胞也显著降低，3天后开始缓慢恢复，7天时恢复正常；骨髓和脾脏中CD138+浆细胞的促凋亡因子Chop相对表达量显著增加。硼替佐咪短期治疗后，骨髓和脾脏中淋巴细胞、CD138+浆细胞及长期/短期存活浆细胞均显著低于利妥昔单抗治疗组，而CD19+B细胞高于利妥昔单抗治疗组；其降低HLA-A2抗体的幅度虽强于利妥昔单抗治疗组，但是仍维持较高水平。采用硼替佐咪长期连续治疗后，骨髓淋巴细胞和CD138+浆细胞下降幅度大于CD19+B细胞，且HLA-A2抗体也显著下降，均显著低于对照组，但是治疗间断后淋巴细胞、CD138+浆细胞、CD19+B细胞和HLA-A2抗体逐渐恢复。
　　结论：硼替佐咪长期治疗不仅可以有效降低HLA-A2抗体滴度和骨髓和脾脏中淋巴细胞、CD138+浆细胞，而且可以有效减少长期存活浆细胞和骨髓中前/祖B细胞。

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中文摘要

英文摘要

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引言

参考文献

第一部分 应用原核表达系统制备重组人HLA-A2蛋白

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 应用重组HLA-A2蛋白建立预存抗HLA-A2抗体的BALb/c小鼠模型

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 清除高致敏小鼠体内预存HLA-A2抗体的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述: 抗体介导排斥反应的类型、特征及干预措施

攻读学位期间公开发表的论文

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