肾移植受者HCMV感染与BAFF信号活化的相关性研究

摘要

目的：
　　研究肾移植受者人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染与B细胞活化因子（B cell activating factor belong to the TNF family,BAFF）信号的相关性。
　　方法：
　　①以来院随访的肾移植受者为研究对象，共采集113例患者抗凝外周血（EDTA-Na2抗凝）和尿液样本。采用real-time PCR法检测尿液中HCMV DNA水平。
　　②应用real-time PCR法检测外周血单个核细胞中BAFF、BAFF-R、TLR9、NLRC5、TACI等HCMV-TLR信号和BAFF信号通路中相关因子的转录本水平；PCR芯片技术对TLR信号通路、NF-κB信号通路，以及细胞因子-细胞因子受体通路中共88个基因进行研究，以筛选肾移植受者HCMV DNA阳性组和阴性组的差异表达基因。健康志愿者为对照。
　　③ELISA法检测血清sBAFF和总IgG水平；间接荧光免疫试验（IFA）检测血清中抗HCMV pp65 IgG、IgM抗体水平，流式荧光法（Luminex）检测血清抗人类白细胞抗原HLA抗体和抗MICA抗体水平（抗HLA-Ⅰ&Ⅱ&MICA抗体）。
　　④采用SPSS17.0统计软件包进行分析。两个独立样本均数间的比较采用双侧t检验；相关性分析采用Spearman法及Pearson法；P<0.05被认为具有统计学意义。
　　结果：
　　①113例来院随访肾移植病人中，尿HCMV DNA>10,000拷贝/ml为12例，归为阳性组；HCMV DNA<10,000拷贝/ml的为83例，以及未出现扩增的18例，归为阴性组。
　　②ELISA结果显示，阳性组患者血清sBAFF、总IgG水平显著高于阴性组（928±360 pg/ml vs511±298 pg/ml,P<0.05;26,260±15,960μg/ml vs9,944±7,365μg/ml, P<0.05）；IFA结果显示，阳性组患者血清抗HCMV pp65 IgG水平显著高于阴性组（P<0.05）；阳性组中尿HCMV DNA拷贝数与sBAFF呈正相关（r=0.988,P<0.05），sBAFF与血清中总IgG呈正相关（r=0.625, P<0.05）。
　　③Luminex检测结果显示，阳性组中抗HLA-Ⅰ&Ⅱ&MICA抗体的阳性率为46.2％，阴性组为12.5%，差异无统计学意义。
　　④real-time PCR发现，与尿HCMV DNA阴性组比较，阳性组BAFF mRNA水平显著增高（P<0.05），其余分子（BAFF-R、TLR-9、NLRC5、TACI等）的表达未出现显著差异；基因芯片检测结果发现，表达差异基因共有46个，其中阳性组与阴性组相比较表达上调的基因有2个（BAFF-R、ICAM1），表达下调的基因22个（TLR-9、NLRC5、LIGHT等）；阳性组与健康对照组相比较，表达上调的基因有2个（IFN-γ、ICAM1），表达下调的基因8个（CCL3L1、IL12B、ILIR1等）；阴性组与健康对照组相比较表达上调的基因有11个（IFN-γ、IRAK4、NF-κB2等），表达下调的基因1个（BAFF-R）。
　　结论：
　　肾移植受者HCMV感染后，HCMV-TLR信号活化可能引发或促进BAFF信号活化；HCMV-TLR信号与BAFF信号独立或协作参与移植肾损伤。
　　第二部分
　　目的：体外探索HCMV-TLR9信号与BAFF信号串话的可能机制和效应。
　　方法：
　　①HCMV感染HFL-1细胞，以无HCMV感染的HFL-1细胞作对照。在感染第1，3，5，7天时收获细胞，提取全蛋白。Western Blot法分析NLRC5、TLR9、TRAF6、IRAK4等蛋白在各不同时相的表达水平变化。
　　②HCMV直接感染人扁桃体B淋巴细胞，或以HCMV感染后的HFL-1细胞与扁桃体B淋巴细胞共培养。在共培养第1，3，5，7天后收获细胞和培养上清。流式分析各个时相B细胞的凋亡率及CD19+、BAFF+、BAFF-R+、TACI+、BCMA+的表达强度；ELISA检测不同实验分组细胞培养上清的IgG分泌水平。另外，用5μg/ml CpG ODN2006及其阴性对照，2.5μg/ml CpG ODN4084-F和50μg/ml Poly(I:C)，及200 ng/ml重组BAFF蛋白体外作用于B细胞作为对照。
　　③采用中和性抗BAFF-R抗体在HCMV或CpG ODN2006感染B细胞之前或之后阻抑BAFF信号，继续培养5天，收集相应的细胞和细胞培养上清，分别用流式和ELISA检测B细胞凋亡率和分泌IgG水平，以分析HCMV感染、BAFF信号串话对B细胞生长及功能的影响；以HCMV、CpG ODN2006、抗BAFF-R抗体单独作用作为对照，以不加任何刺激剂作为空白对照。体外实验用来分析HCMV感染对B细胞生物学功能的影响。
　　④采用SPSS17.0统计软件包进行分析。两个独立样本均数间的比较采用双侧t检验；多组实验间采用ANOVA方法进行两两比较；P<0.05被认为具有统计学意义。
　　结果：
　　①Western Blot结果显示HCMV感染HFL-1细胞后，TLR9的表达水平随感染时间先升高后下降，TRAF6和IRAK4则随时间呈下降趋势（时相间差异具有统计学意义），NLRC5水平则未出现明显变化；对照组中各蛋白表达水平随时间均未出现明显变化。
　　②与HCMV感染的HFL-1细胞共培养的B细胞凋亡率在培养的第1-3天和第5-7天间出现显著的上升，但在第0-1天、第3-5天之间则出现平台期；与正常HFL-1细胞共培养的B细胞凋亡率呈现持续上升趋势。HCMV直接刺激B细胞，B细胞的早期凋亡率在第1-5天未出现明显上升；CpG ODN2006直接刺激B细胞，B细胞的早期凋亡率在第0-1天下调，第1-5天缓慢上调；CpG ODN2006 Control和rhBAFF直接刺激B细胞，B细胞的早期凋亡率与不加任何制剂刺激相比无显著差异；CpG ODN4084-F、Poly(I:C)刺激的B细胞的凋亡率持续上升，且在相应的时间点高于对照组；对照组中未用任何制剂刺激的B细胞早期凋亡率持续上升。
　　③HCMV直接或间接感染 B细胞，B细胞表面BAFF-R持续高水平表达；受 rhBAFF和 CpG ODN2006刺激的B细胞 BAFF-R表达水平与HCMV感染类似。CpG ODN2006 Control、CpG ODN4084-F、Poly(I:C)刺激组和对照组中B细胞BAFF-R表达水平未出现明显规律。B细胞表面BAFF及其受体TACI、BCMA的表达水平在各实验组中均未发现明显变化趋势。
　　④HCMV刺激B细胞之前阻抑BAFF信号，B细胞凋亡率上升，但IgG分泌水平无显著变化；CpG ODN2006刺激B细胞之前阻抑BAFF信号，B细胞凋亡率显著上升，IgG分泌水平显著下降；HCMV、CpG ODN2006、抗BAFF-R抗体单独刺激B细胞对其早期凋亡率无显著影响，HCMV、CpG ODN2006单独刺激B细胞后B细胞IgG分泌水平上调。
　　结论：
　　HCMV感染可在一定时间范围内增强HCMV-TLR9信号；HCMV-TLR9信号与BAFF信号串话，并在一定程度上抑制B细胞凋亡。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

第一部分 肾移植受者HCMV感染与BAFF信号活化的相关性分析

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第二部分 HCMV体外感染人胚肺成纤维细胞及其对人B淋巴细胞的作用机制研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

综述:肾移植术后人巨细胞病毒感染的相关研究

中英文缩略词表

攻读研究生期间发表论文

致谢