硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态

摘要

研究目的：硫化氢（H2S）是重要的内源性气体信号分子。本课题组研究表明在LPS导致的中枢神经炎症模型中 H2S通过 AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）激活选择性诱导小胶质细胞另类（M2）极化。我们还发现H2S供体在动物模型中抑制脑缺血后过度的中枢神经炎症，但分子机制尚不明确。基于前期研究，本课题的目的是探讨硫化氢是否在脑缺血后通过AMPK活化促进小胶质细胞M2极化，进而促进抑制枢神经炎症并脑缺血后血管新生。
　　研究方法：收集神经元缺氧缺糖（oxygen-glucose deprivation, OGD）处理后的细胞培养上清，以此条件上清处理 BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞模拟体内脑缺血激活小胶质细胞的体外模型；应用小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）法建立动物缺血性脑卒中模型。利用缓释 H2S供体（ADT-OH）和过表达胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase, CBS）的方法研究H2S选择性诱导小胶质细胞M2极化的机制。应用Western Blot技术检测AMPK活化（磷酸化）、CBS以及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表达；通过实时荧光定量 PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）技术检测M1(促炎状态)/M2（抗炎状态）细胞因子的表达变化；应用AMPK和CaMKKβ抑制剂以及 siRNA技术探索 H2S促进小胶质细胞 M2极化是否依赖于 AMPK及CaMKKβ；利用脑微血管内皮细胞（bEnd3）在基质胶上形成血管状结构的能力探讨在条件上清处理时 ADT-OH是否通过小胶质细胞 M2极化促进血管新生。在动物水平上，通过小鼠MCAO模型验证H2S供体对AMPK活化和M1/M2细胞代表因子的表达的影响。
　　结果：在神经元缺氧缺糖条件上清处理 BV2小胶质细胞或原代小胶质细胞建立的脑缺血激活小胶质细胞的细胞模型中，Western Blot结果显示：与溶剂对照组(Con)和正常神经元培养基（Neuron Condition medium,Neuron CM）处理的对照组相比，经缺氧缺糖神经元条件上清处理（OGD Neuron Condition Medium, OGD Neuron CM）的小胶质细胞AMPK活化水平明显降低(P<0.05)，而ADT-OH在OGD Neuron CM处理时显著提高小胶质细胞AMPK活化水平（P<0.05）。Q-PCR/ELISA结果显示：OGD Neuron CM导致小胶质细胞M1极化代表因子（iNOS，IL-1β，IL-6，TNF-α）表达明显升高(P<0.05)；ADT-OH则下调OGD Neuron CM诱导的M1极化代表因子的表达、并显著上调OGD Neuron CM抑制的M2极化代表因子（ARG,YM1/2,IL-10）的表达(P<0.05)。这些结果表明，OGD Neuron CM导致小胶质细胞M1极化，ADT-OH在OGD Neuron CM处理时促进小胶质细胞向M2状态转化。利用神经元条件上清刺激BV2小胶质细胞后检测CBS和CSE的表达,Western Blot和Q-PCR结果均显示：与溶剂对照组(Con)和正常神经元培养基（Neuron Condition medium,Neuron CM）处理的对照组相比，经缺氧缺糖神经元条件上清处理（OGD Neuron Condition Medium, OGD Neuron CM）的BV2小胶质细胞CBS表达水平明显降低(P<0.05)，CSE表达水平没有明显变化。在BV2小胶质细胞中过表达 CBS或转染 Vector（对照），无论是否存在OGD Neuron CM刺激，与转染Vector组的BV2细胞相比，过表达CBS的BV2细胞组AMPK活化水平均显著升高，同时CBS过表达组在OGD Neuron CM处理时明显促进BV2细胞向M2活化状态转化(P<0.05)。此外，AMPK抑制剂和AMPK siRNA以及 CaMKKβ抑制剂均抑制 ADT-OH对 BV2细胞向 M2状态转化的促进作用(P<0.05)。以上实验结果说明，ADT-OH通过促进AMPK活化而促使BV2细胞向M2状态转化。
　　应用脑微血管内皮细胞（bEnd3）研究ADT-OH通过小胶质细胞M2极化对促进血管新生的作用。OGD Neuron CM和ADT-OH同时处理BV2小胶质细胞24h后获得的条件培养液（OGD Neuron CM+ADT-OH）促进bEnd3细胞在基质胶上形成血管状结构，而OGD Neuron CM或Neuron CM处理BV2细胞后获得的条件培养液、以及正常BV2细胞培养液均不能促进bEnd3细胞在基质胶上形成血管状结构。利用BV2细胞转染AMPK siRNA或NC siRNA（对照）研究AMPK对血管新生的影响，结果显示：与NC siRNA（对照）相比，OGD NeuronCM和ADT-OH共处理转染siAMPK的BV2细胞后获得的条件培养液（OGD NeuronCM+ADT-OH+siAMPK）不能促进bEnd3细胞形成血管状结构。这些结果表明：经神经元条件上清处理后ADT-OH通过AMPK介导的小胶质细胞M2极化机制促进血管的新生。
　　在小鼠脑缺血模型中，ADT-OH能够促进皮层组织中AMPK的活化(P<0.05)，抑制M1细胞代表因子的表达并且上调M2细胞代表因子的表达(P<0.05)。在动物水平上表明了H2S可能通过活化AMK抑制缺血性神经炎症。
　　结论与创新：我们首次表明H2S通过AMPK介导的小胶质细胞M2极化机制在脑缺血后调控中枢炎症应答并促进血管新生。

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引言

实验材料

1.1 细胞：

1.2 动物：

1.3 药品及试剂：

1.4抗体及仪器：

1.5 试剂制备：

实验方法

2.1 BV2小胶质细胞系培养：

2.2原代小胶质细胞培养：

2.3 原代神经元的培养：

2.4体外神经元缺氧、缺糖（Oxygen-glucose deprivation,OGD）模型的建立

2.5 MTT法检测BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞存活率：

2.6 CBS质粒转染BV2细胞实验

2.7 CBS/Vector质粒转染BV2细胞：

2.8 siRNA干扰敲除AMPK基因（按试剂盒说明书操作）：

2.9 脑微血管内皮细胞（bEND3）系和体外血管新生

2.10 Western Blot

2.11 实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR, Q-PCR）

2.12 酶联免疫吸附实验（ELISA）：IL-10 含量检测（按照试剂盒说明书操作）

2.13 大脑中动脉阻塞模型（MCAO模型）

2.14统计学方法

实验结果

1.神经元条件上清刺激 BV2 小胶质细胞模型中，硫化氢供体（ADT-OH）诱导BV2小胶质细胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的活化。

2.神经元条件上清刺激 BV2 小胶质细胞模型中，硫化氢供体（ADT-OH）通过激活AMPK促进BV2小胶质细胞选择性向M2状态转化。

3、Ca2+依赖性蛋白激酶（CaMKKβ）抑制剂 STO609 抑制 ADT-OH 诱导的AMPK活化，同时降低了ADT-OH促进的BV2细胞选择性M2活化状态转化。

4. OGD Neuron CM 抑 制 H2S 合 成 酶 胱 硫 醚 -β- 合 成 酶（cystathionine-β-synthase, CBS）的表达，对胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase, CSE）表达无影响。

5.硫化氢（H2S）内源性合成酶胱 硫 醚 -β-合 成 酶（CBS）质粒过表达上调体外脑缺血模型中的AMPK活化进而促进BV2细胞向M2活化状态转化。

6. H2S供体(ADT-OH)诱导原代小胶质细胞AMPK的活化进而促进小胶质细胞向M2活化状态转化。

7、ADT-OH在体外脑缺血模型中通过AMPK介导的小胶质细胞M2极化机制促进脑血管新生。

8. ADT-OH诱导小鼠脑缺血后AMPK的活化从而促进小胶质细胞选择性向M2活化状态转化，抑制脑缺血引起的中枢神经炎症。

讨论

结论

参考文献

综述: 小胶质细胞M1/M2极化与神经退行性疾病

英文缩略词表

致谢