中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)生殖相关基因的克隆及其表达模式研究

摘要

生殖细胞的发生是发育生物学研究的主要内容之一，同时也是一个复杂的发育调控并涉及时空的多基因活动过程。其中原始生殖细胞起源、迁徙、分化等方面的研究，是备受关注的生物学研究方向。与其他模式生物相比，十足目动物关于生殖发育的分子机制方面的研究相对薄弱。因此，鉴定和发现十足目生殖相关的基因并探索其功能，具有重要意义和潜在的应用价值。本文以中华绒螯蟹为研究对象，通过现有研究和相关文献的查阅，对与中华绒螯蟹生殖发育有着密切联系的vasa、piwi、nanos、PL10基因进行研究。研究主要分为四个部分：
　　1、中华绒螯蟹vasa基因的表达分析及表达模式研究
　　vasa基因是生殖质的主要组成成分之一，且在生殖腺中特异性表达，常可作为示踪生殖腺形成的分子标记。本文采用实时荧光定量PCR技术对vasa基因在中华绒螯蟹胚胎及幼体发育阶段的表达情况进行了研究，研究发现，vasa mRNA在胚胎发育时期表达量相对幼体发育阶段表达量要高，推测vasa mRNA可能主要作用于胚胎发育阶段。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明，vasa mRNA在精母细胞中分布于染色质中，在精子细胞中主要分布于核杯，在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现，胚胎和幼体发育时期vasa mRNA表达集中分布，可根据vasa mRNA的分布初步推断中华绒螯蟹的性腺生成轨迹。
　　2、中华绒螯蟹piwi基因克隆及表达研究
　　Piwi基因在果蝇中有维持生殖干细胞和调节细胞分裂的功能，甲壳类中对此基因的研究非常少。本文采用SMARTTM RACE技术，克隆了piwi基因全长序列。piwi基因的cDNA全长3253bp（GenBank注册号：KR061909），5’UTR26bp，3’UTR179bp，开放阅读框ORF2868bp，编码955个氨基酸。多序列比对和同源性分析表明中华绒螯蟹的piwi基因和三疣梭子蟹的piwi基因同源性为70％。跨模区分析表明PIWI蛋白为亲水性蛋白结构。通过实时荧光定量PCR分析表明，piwi mRNA在血液、肌肉、心脏、胸神经节、鳃、肝胰腺、肠、卵巢、精巢中均有表达。但是在性腺中的表达要明显高于其他各组织，随着精巢的发育变化，piwi mRNA的表达量逐渐减少，在精母细胞时期表达量最高；同样在卵巢中piwi mRNA也随着卵巢的发育而发生波动，在卵母细胞期表达量最高。在胚胎和幼体发育阶段，大眼幼体期表达量最高。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明，piwi mRNA在精母细胞中分布于染色质中，在精子细胞中主要分布于核杯中，在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现，以piwi mRNA阳性信号指示的生殖腺原基在心跳期已比较明显，溞状幼体I期时分布于头胸甲与腹部交接处，随着发育逐渐集中于头胸甲背部，至溞状幼体II期时已向头胸甲迁移，溞状幼体III期时更加集中，完全位于头胸甲的背面的一个区域。
　　3、中华绒螯蟹nanos基因克隆及表达研究
　　nanos mRNA和vasa mRNA是性腺的最初成分P颗粒中的2个最重要的组成成分。本文采用SMARTTM RACE技术，克隆了中华绒螯蟹nanos基因，nanos基因cDNA序列全长2886bp（GenBank注册号：KR061910），5’UTR59bp，3’UTR1543bp，开放阅读框ORF1284bp，编码427个氨基酸。跨膜区分析表明NANOS蛋白为亲水性蛋白结构。实时荧光定量PCR分析表明，nanos mRNA在血液、肌肉、心脏、胸神经节、鳃、肝胰腺、肠、卵巢、精巢中均有表达，其中在血液中表达量最低，在性腺中表达量最高，且精巢中表达量高于卵巢。卵巢中nanos基因在卵巢发育的大生长期（对数生长期）早期达到峰值，随着卵巢发育趋向成熟，有下降趋于平缓的趋势；在精巢发育过程中，在7月份的精母细胞期表达量最高，后逐渐降低，至精子发生早期又急剧升高，形成精子后迅速下降。在胚胎和幼体发育时期，在大眼幼体期的表达量最高，与其他各期差异极为显著。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明，nanos mRNA在精母细胞中分布于染色质中，在精子细胞中主要分布于核杯中，在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现，以nanos mRNA阳性信号指示的生殖腺原基在出膜前期比较明显，溞状幼体I期时nanos阳性信号分布于头胸甲与腹部交接处，随着发育逐渐集中于头胸甲背部，至溞状幼体II期时已完全分布于头胸甲，溞状幼体III期时更加集中，完全位于头胸甲的背面的一个区域。
　　4、中华绒螯蟹PL10基因克隆及表达研究
　　PL10基因是vasa的祖先基因。本实验克隆得到的中华绒螯蟹PL10基因片段序列长1671bp（Genbank注册号：KR061911），编码566个氨基酸。多序列比对和同源性分析表明中华绒螯蟹的PL10基因和秀丽白虾、日本沼虾、中国明对虾同源性分别为85%、84%、84%。系统进化分析证明了PL10基因在进化上高度保守。实时荧光定量PCR分析表明，PL10 mRNA在各组织中均有表达，但表达量差异较大，血液、神经节、鳃组织中低量表达，肝胰腺、精巢、卵巢中高量表达。对中华绒螯蟹各发育阶段性腺中PL10 mRNA的实时荧光定量PCR实验表明，在12月份的精子形成期达到高峰，说明PL10基因参与了精子的发生；在卵巢中PL10 mRNA的表达在对数增长前期有小幅上升，对数生长期后则呈下降趋势。实时荧光定量PCR实验表明，PL10基因在胚胎中的表达量高于幼体阶段。
　　研究发现，在胚胎发育各期及溞状幼体阶段，vasa和nanos的表达模式相似，说明在此过程中两者功能相近；PL10基因在胚胎发育的早期阶段的表达量要高于vasa和nanos，说明PL10的功能与vasa和nanos不尽一致。通过以上的研究和分析，中华绒螯蟹生殖相关基因piwi、nanos和PL10基因cDNA序列的获得，丰富了中华绒螯蟹遗传学资源，可为解决中华绒螯蟹养殖过程中的性早熟、个体规格不统一现象提供基础资料，具有一定意义。与其他模式动物相比，甲壳动物生殖生理的分子机制研究相对薄弱，本实验对于中华绒螯蟹生殖相关基因的研究，可望为中华绒螯蟹的遗传育种改良提供相应的理论依据。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1前言

2各生殖相关基因的选取

3本研究的目的及意义

第二章 中华绒螯蟹vasa基因的表达分析及表达模式研究

1前言

2材料与方法

3结果

4.讨论

第三章 中华绒螯蟹piwi基因克隆及表达研究

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

第四章 中华绒螯蟹nanos基因克隆及表达研究

1前言

2材料和方法

3结果

4.讨论

第五章 中华绒螯蟹PL10基因克隆及表达研究

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

全文结论

参考文献

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢