羧肽酶Y标记蛋白质羧基端方法的优化及其应用

摘要

目的：
　　蛋白质水解作为一种重要的翻译后修饰，在细胞凋亡、肿瘤细胞转移等生物化学过程中起着极其重要的作用。鉴定蛋白质水解位点可以进一步加深我们对这些生化过程的认识。近年来，鉴定蛋白质水解的氨基端蛋白质组学方法层出不穷，但羧基端组学方法却很少。本课题中，我们首先将对蛋白质羧基端生物酶标记（ProC-TEL）和亲和纯化效率两个方面进行优化，将优化后的ProC-TEL和正向分离羧基端多肽方法应用到E.coli全蛋白样品中，以期对蛋白质复杂样品的羧基端多肽进行正向分离富集并用质谱鉴定。其次，将优化后的ProC-TEL和正向分离的方法应用到药物诱导凋亡的多发性骨髓瘤细胞样品中，鉴定凋亡过程中蛋白质的水解。最后，探索数个羧肽酶Y突变体在ProC-TEL中的应用，探寻转肽酶活性更好的羧肽酶Y突变体，从而对蛋白质样品进行高效的羧基端标记。
　　方法：
　　蛋白质C端羧肽酶Y标记方法是首个正向标记分离蛋白质C端多肽的方法。本课题中，通过优化该方法中生物素标记反应的pH值以获得标记产物均一的实验条件；通过研究SDS含量对生物素标记效率的影响，对羧肽酶Y标记技术进行优化；通过对E.coli全蛋白复杂样品羧基端亲和标记、亲和纯化和质谱鉴定，对复杂样品中蛋白质水解位点进行高通量检测；利用台盼蓝染色法、CCK-8检测法和Western blotting检测5，6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）对多发性骨髓瘤细胞发生凋亡的调控；联合优化后的ProC-TEL技术、亲和纯化和质谱鉴定对药物诱导的多发性骨髓瘤OPM2细胞凋亡过程中的水解进行质谱鉴定；通过羧肽酶Y突变体的构建、表达及其在生物素标记实验中的应用，筛选可能提高生物素标记效率的突变体羧肽酶Y，进行羧肽酶Y介导的生物素标记实验。
　　结果：
　　1）通过对比模型肽Ac-ASLTDYVKSYGA在不同pH条件下生物素标记样品的MALDI-TOF-MS检测结果发现：在pH=11.5的反应条件下，生物素标记产物较为均一。
　　2）通过增加生物素标记体系中反应缓冲液中SDS的含量和甲基酯化反应后复溶缓冲液中SDS的含量，从Western blotting检测和银染结果发现，当反应体系中SDS含量为0.5％时为最佳生物素标记条件。
　　3）通过MALDI-TOF-MS以及LC-MS/MS结果发现，优化后的ProC-TEL技术联合亲和纯化以及质谱分析能够正向分离检测单一蛋白质C端多肽。
　　4）用优化后的羧基端标记方法来标记E.coli复杂蛋白样品羧基端，纯化后共鉴定到了120多个蛋白质羧基端多肽。
　　5）用优化后的ProC-TEL技术检测100?M DRB加药处理6 h诱导的多发性骨髓瘤OPM2细胞凋亡过程中的水解，DMSO对照组共检测到了81个生物素标记多肽，DRB加药组共鉴定出了88个生物素标记多肽，并发现多个凋亡酶水解底物蛋白。
　　6）在探索实验中，发现尽管野生型以及突变体羧肽酶Y可以在原核表达体系中成功表达，但其介导的生物素标记效率并没有明显提高。
　　结论：
　　优化后的ProC-TEL技术可以更好地联合亲和纯化及质谱鉴定对蛋白质的羧基端多肽进行正向分离和鉴定。在E.coli复杂蛋白样品中鉴定出了31个蛋白质内部水解位点，有多个水解蛋白可能在调节蛋白质合成以及氧化还原反应中发挥着重要的作用。由于产生的新的N端多肽太长或太短，这些蛋白质水解后约有48%的水解位点不能被氨基端组学的方法鉴定出来。其次，优化后的ProC-TEL在多发性骨髓瘤细胞凋亡过程中鉴定出了11个新的凋亡酶水解位点。
　　综上所述，本课题优化的正向标记分离蛋白质C端多肽的方法是氨基端组学的一个有利补充，可以为鉴定许多生物化学过程（如细胞凋亡、肿瘤细胞转移和侵袭等）中特定蛋白酶水解位点及底物的鉴定提供一个互补的组学方法。

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第一章 前 言

1.1 羧肽酶Y概述

1.2 蛋白质水解及质谱鉴定

1.3 多发性骨髓瘤凋亡

第二章 羧肽酶Y标记蛋白质C端和正向分离蛋白质C端多肽

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 结论

第三章 多发性骨髓瘤OPM2细胞凋亡过程中蛋白水解的鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 结论

第四章 探索CPY突变体在羧肽酶标记蛋白质

4.1 实验材料和仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果与讨论

4.4 结论

参考文献

综述: 蛋白质C端多肽分析方法概述

攻读学位期间出版或公开发表的论著、论文

中英语缩略词对照表

附录

致谢