再生丝素纤维的制备及其在人工韧带中的应用

摘要

前交叉韧带（Anterior cruciate ligament，ACL）是膝关节内的核心结构，对膝关节的稳定性起着重要作用。目前我国因运动和交通事故等造成ACL损伤的现象明显增多，其损伤断裂会导致膝关节稳定性差等问题的出现，严重损伤还会影响膝关节功能，因此我国对ACL修复材料市场需求量急剧增加。丝素蛋白（SF）因其良好的可塑性、生物相容性，可以克服早期移植物的免疫排斥反应而成为制备生物医用材料的理想素材。发挥再生SF纤维可降解性以及天然SF纤维优良力学性质的优势，本文拟制备以SF为原料的可降解型再生SF纤维复合韧带。
　　采用氯化钙（CaCl2）-甲酸（FA）溶解体系在常温下破坏原纤内的结晶结构分纤溶解蚕丝，利用湿法纺丝、静电纺丝技术制备再生SF纤维，探讨不同溶解参数对溶液溶解性的影响以及溶液性质对再生加工过程、纤维形貌及力学性能的影响。在此研究基础上，通过体外降解和细胞培养实验验证再生SF纤维的降解性及生物相容性。该溶解体系下溶液中的原纤结构为制备高性能再生纤维提供保障，故选用再生SF长丝、静电纺再生SF纳米纤维以及天然SF纤维为原料构建再生SF纤维复合韧带，为开拓以SF为基材的韧带修复材料提供新思路。
　　传统溶解方法（CaCl2-C2H5OH-H2O）极大地破坏了蚕丝的原纤结构，甚至是分子结构，严重影响了再生SF材料的性能，同时对中性盐浓度、溶解温度以及溶解时间的要求更高。本文采用CaCl2-FA溶解体系通过强极性离子产生的水化作用使纤维溶胀、体积增大，削弱了分子间氢键作用，可以常温条件下分纤溶解蚕丝并破坏原纤内的β-折叠结晶结构达到溶解蚕丝的目的。在SF溶液及干燥膜中都能清晰观察到原纤结构，溶液中的原纤尺寸随CaCl2浓度、溶解温度的增加呈现减小的趋势。该溶解方法能获得粘度更高的溶液，SF在溶液中的溶解度会随着CaCl2浓度、溶解温度的增加而增加。此外，该溶解法制备的SF膜材料为水不溶性物质，去离子水浸泡可以诱导其由无规卷曲向β-折叠结构转变。
　　溶液中的原纤结构在湿法纺丝过程中经过凝固浴并受到剪切作用重组成纤维，以水为凝固浴、质量分数为15.0wt.％的SF溶液湿法纺丝，4倍牵伸后可获得直径为10.8±1.4μm、断裂应力达358.4±43.2MPa、断裂伸长率达24.8±4.2%的SF长丝，力学性能有明显提高。此外，水浴凝固具有对环境无污染、低成本、易操作等优点。
　　将CaCl2-FA溶解体系获得的SF溶液干燥成膜后溶解于甲酸得到仍保留原纤结构的SF溶液进行静电纺丝，采用自制滚筒收集装置获得取向纳米纤维，并与细胞外基质（ECM）具有相似的尺寸结构。讨论不同CaCl2浓度制备得到的纺丝液、不同SF浓度对成纤性的影响，分析滚筒转速和拉伸对纤维取向性的影响。结果表明SF质量分数为6.0wt.%、CaCl2质量分数为5.0wt.%、滚筒转速为1000rpm获得直径为221±20nm的纤维，1倍牵伸后纤维的断裂应力和断裂伸长率分别达到了18.6±3.8MPa和15.1±2.5%，纤维局部取向度明显改善，力学性能较CaCl2-C2H5OH-H2O溶解方法的纤维有较大幅度提高。
　　再生SF纤维在PBS溶液中降解相对缓慢，降解60天，SF纳米纤维重量损失15%，纤维间部分出现粘连现象；SF长丝重量损失8.9%，降解只发生在纤维表面、出现部分裂痕。而蛋白酶XIV溶液对材料的降解能力明显增强，降解48h时，SF纳米纤维几乎完全降解，SF长丝重量损失61.5%，纤维主体分解。取向排列的SF纳米纤维较乱序纳米纤维可以在短时间内明显促进细胞的大量生长，SF长丝和天然SF纤维也利于细胞生长粘附，具有良好的生物相容性。
　　基于高性能再生SF纤维的制备，采用立式锭子编织机，以SF长丝为轴纱，天然SF纤维编织物、静电纺SF纳米纤维包裹的形式构建再生SF纤维复合韧带，结构稳定，断裂强力达2581.7±23.7N，满足人体ACL的要求。不同SF纤维在酶溶液中呈现出降解差异，再生SF纤维的快速降解为细胞再生提供有利的生长空间，降解速度慢、性质稳定的天然SF纤维支架保证了韧带材料的力学要求，实现了不同材料降解速度差异化的设计要求。
　　本文采用CaCl2-FA溶解体系获得的再生SF纤维表现出良好的性能，开发设计出以SF纤维为原料、既保证力学要求又充分发挥其良好生物相容性和可降解性的人工韧带，为制备韧带修复材料提供一定的实验依据。

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第一章 绪 论

1.1 再生SF材料的制备与应用

1.2 ACL损伤与重建

1.3 本文研究内容与创新点

参考文献

第二章 天然蚕丝在CaCl2-FA溶解体系中的溶解性分析

2.1 实验

2.2 结果与讨论

2.3 溶解机理讨论

2.4 本章结论

参考文献

第三章 再生丝素长丝的制备及性能研究

3.1 实验部分

3.2 结果与讨论

3.3 本章结论

参考文献

第四章 静电纺再生丝素纳米纤维的制备及性能研究

4.1 实验材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 本章结论

参考文献

第五章 再生丝素纤维降解性及生物相容性研究

5.1 SF纳米纤维的降解性研究

5.2 SF材料的生物相容性研究

5.3 本章结论

参考文献

第六章 再生丝素纤维复合人工韧带的构建

6.1 SF纳米纤维构建人工韧带

6.2 SF长丝构建人工韧带

6.3 天然SF纤维构建人工韧带

6.4 再生SF纤维复合构建人工韧带

6.5 本章结论

参考文献

第七章 结论与展望

7.1 主要结论

7.2 不足与展望

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢