家蚕生物钟负反馈环路分子机制研究

摘要

时间生物学是美国Scie nce杂志1999年度评选出的21世纪最重要的三大学科之一，是研究生物与自然生活环境协同进化及其机制的重要突破口。时间生物学关注生物体的内源性生物钟系统和生物节律的作用机制、以及周期性生理功能变化规律等内容，其中以近24h为循环周期的昼夜节律研究备受关注。时间生物学的应用已经进入医学、农学等生命科学的多个领域，正发挥着越来越大的作用。
　　昆虫的生物钟研究主要集中在果蝇、蟑螂和大红斑蝶。家蚕是被畜牧化大规模饲养的经济昆虫，也是鳞翅目唯一的模式昆虫，具有重大的经济价值和独特的农业模式昆虫研究意义。本文在实验室长期开展的家蚕昼夜节律生物钟核心钟基因研究基础上，运用Western blotting、细胞免疫荧光、CO-IP、IF和免疫组织化学等实验技术手段，研究了家蚕生物钟调控机制及其与孵化行为的联系。主要结果总结如下：
　　1.BmN细胞内源生物钟系统昼夜节律调控机制
　　对家蚕BmN细胞中昼夜节律生物钟核心钟蛋白质CRY1、CRY2、PER和TIM亚细胞定位研究发现，CRY1只存在于细胞质，CRY2、PER和TIM在细胞质和细胞核中都存在；核质分离蛋白表达量Western blotting测定和钟蛋白相互作用的免疫共沉淀调查结果表明，CRY1、CRY2、PER和TIM蛋白表达量均具有典型的昼夜节律变化，细胞质中检测到CRY1与P ER二聚体，CRY2分别与P ER和TIM的二聚体在细胞质和细胞核中都有发现。参照果蝇和大红斑蝶的核心钟蛋白质的相互作用机制，推测家蚕BmN细胞中CRY1作为光感受器，将接收的光信号传递给PER，激活PER结合CRY2，PER/CRY2二聚体进入细胞核，进一步与CLK/CYC二聚体结合，阻止该二聚体激活E-box的基因转录活性，从而实现抑制Per、Tim和Cry2基因的转录。黑暗模式下，敏感性较强的TIM结合CRY2，限制了PER/CRY2二聚体形成，进一步可能阻止PER/CRY2通过CLK/CYC二聚体对E-box的基因转录活性抑制效应。
　　2.BmN细胞响应温度授时因子的节律机制
　　CRY1、C RY2、P ER和TIM蛋白质亚细胞定位结果显示，恒暗20℃:30℃(12 h:12h)温度循环与光照授时因子作用相似；核质分离蛋白表达量Western blotting测定结果表明，温度也可导引B mN细胞内源生物钟，但振荡节律与光照授时不一致。CRY1没有呈现光照授时类似的振荡节律性；CRY2对温度感应较光照更为敏锐；PER和TIM蛋白质表达量的节律性不明显，PER和TIM的亚细胞定位区域不同，PER主要集中在细胞核，而TIM主要出现在细胞质。推测CRY2更可能是温度授时信号感应物，PER是一个负性调控元件，TIM是运输工具，具体的应答温度信号传输机制尚不清楚。
　　3.家蚕胚胎头部生物钟核心振荡系统与孵化行为发生相关
　　恒温下昼夜明暗12L：12D驯化和30 min瞬时光照刺激结果都表明，家蚕后期胚胎接收光照信号后，头部组织中CRY1和CRY2蛋白质的表达量逐渐上升，其中CRY1更为显著；PER蛋白的表达量虽没有明显的节律变化，但伴随光照刺激出现了由细胞质向细胞核内转运的现象。推测胚胎头部的CRY1作为光感受器，接受了光照节律（或光刺激）授时信号，启动了核心生物钟负反馈信号通路，进一步调控影响了胚胎的出壳孵化行为（节律）。

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第一章 绪 论

1 生物钟研究进展

2 家蚕生物钟研究现状

3 生物钟研究意义和展望

4 论文研究思路

第二章 家蚕BmN细胞响应光照授时因子的分子机制

1 材料与方法

2 结果与分析

3小结

第三章 家蚕BmN细胞响应温度授时的分子机制

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第四章 光诱导的家蚕卵孵化行为与生物钟调控

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结

第五章 结论

1 全文总结

2 论文创新点

3 后续研究展望

参考文献

攻读研究生期间发表论文

资助项目

附录 文中主要缩略词一览表

致谢