异基因造血干细胞移植治疗难治复发急性髓细胞白血病的临床及实验研究

摘要

【目的】
　　1.回顾总结本中心应用异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗的难治复发急性髓细胞白血病（rAML）患者，研究影响预后的关键因素。
　　2.应用高通量二代测序技术检测初诊及接受allo-HSCT后复发的rAML患者的肿瘤相关基因突变和克隆演变。
　　3.研究Notch2基因在AML中的表达水平及可能的致白血病机制。
　　【方法】
　　1.回顾性收集101例于2003年10月至2012年12月期间，在苏州大学附属第一医院接受allo-HSCT的rAML患者，分析其年龄、FAB分型、分子/细胞遗传学、疾病状态、体能状态、化疗次数、移植类型等临床特征与移植后并发症及预后的影响。
　　2.收集23例原发性rAML初诊标本和20例AML患者（12例AML及8例rAML）初诊及allo-HSCT后复发时的成对样本，应用DNA+RNA特异性基因Panel对390个肿瘤相关基因进行DNA测序（全部外显子及相关内含子）及全转录组测序（RNA-seq）。DNA平均测序深度为300×，RNA-seq测序深度为50M reads。分析rAML患者初诊时基因突变特征及移植后复发时的克隆演变。
　　3.采用实时荧光定量 PCR技术检测我中心52例初诊成人AML患者、10例急性淋巴细胞白血病（ALL）及10例健康对照的Notch2基因mRNA表达水平。比较Notch2基因mRNA表达水平在 AML患者和ALL患者及正常对照之间以及AML各亚组之间的差异。分析Notch2 mRNA表达量与无病生存率（DFS）和总生存率（OS）之间的关系。同时制备Notch2过表达载体及靶向抑制Notch2的shRNA质粒载体，分别转染髓系白血病细胞株THP-1，采用绝对计数等方法检测其对细胞生长的影响。
　　【结果】
　　1.101例接受allo-HSCT的rAML患者临床特征与预后的研究
　　101例rAML患者中位年龄34岁（14-58），所有患者均接受清髓性移植。移植方式情况如下：1）38例HLA全相合同胞移植，2）33例HLA相合无关供体移植，3）30例HLA不全相合的亲缘移植。53例患者（52％）在移植前疾病缓解（CR组），而48例患者未缓解（NR组）。与CR组患者相比，NR组有更多患者存在FLT3-ITD突变（P=0.006），且体能状态更差（P=0.001），有更多患者行无关供体移植（P=0.027），更少例数接受再诱导化疗（P=0.002）。CR组患者5年OS为46%，而NR组为18%，两组5年累计复发率分别为45%和81%。然而，两组5年NRM是相似的（分别为28%和30%）。
　　CR患者中，32例移植前MRD检测阳性（MRDpos），21例MRD阴性（MRDneg）。两组患者年龄、性别、FAB分型、危险分层及体能状态分布相似。MRDneg患者和MRDpos患者的5年预期OS分别为51%和41%（P=0.37），5年预期DFS分别为55%和36%（P=0.20），5年预期RI分别为21%和29%（P=0.43）。
　　所有患者单因素分析发现，非M5/M6型AML，低危组细胞遗传学和分子遗传学、移植时CR状态以及移植前较好的体能状态与生存率正相关。多因素分析发现，与较好预后相关的因素是移植前CR状态（风险比[HR]=0.31,95% CI0.12-0.81，P=0.017）和较好的体能状态评分（Zubrod-ECOG-WHO<3）。CR组患者单因素分析提示，非M5/M6型AML、低危组细胞遗传学和分子遗传学、FLT3-ITD突变阴性、良好的体能状态和化疗疗程数量≤4次与患者的生存率正相关。多因素分析发现三个独立的预后因素与较长的生存时间相关，分别是较好的体能状态（Zubrod-ECOG-WHO<3）（HR=0.13,95%CI0.045-0.391，P<0.001）、细胞遗传学低/中危组（HR=0.30,95%CI0.103-0.853，P=0.026）和无FLT3/ITD突变（HR=0.22,95% CI0.058-0.831，P=0.024）。
　　2.allo-HSCT治疗rAML后复发克隆演变的初步研究
　　（1）rAML患者初诊时基因突变特征23名rAML患者初诊时每个样本检出基因异常的中位数为4个（2-15）。出现频率最高的基因异常为FLT3突变。其次为TET2突变和MLL融合基因。生存分析发现，携带FLT3突变及MLL融合基因患者似乎预后更差，应用FLT3抑制剂能提高FLT3-ITD患者诱导缓解率，改善预后（2年OS33%vs.75%）。
　　（2）AML患者初诊及移植后复发时的基因改变20位AML患者初诊时最常见的四种基因突变为FLT3、DNMT3A、CEBPA和NPM1。涉及信号通路和表观遗传调控的基因突变最为多见。8名难治复发患者最常见的基因突变为FLT3和TET2。
　　移植后首次复发时，出现突变频率较高的基因为MSH3、KMT2C、TSC2、WT1和NOTCH2。涉及表观遗传学及抑癌基因的基因突变最为多见。难治复发患者中，TSC2、TNFAIP3、IGF1R、WT1出现率最高。其中，Notch2基因突变只发生于移植后复发时，初诊时并未发现，且4例患者中有3名为难治复发患者。
　　（3）移植后复发时克隆的演变移植后复发时克隆演变三种模式：①移植后复发时的基因突变与初诊时检测的基因突变无一相同，即复发时出现一群新的克隆。②移植后复发时，在初诊基因异常的基础上获得了新的基因异常。③在移植后复发时缺失了1个或多个基因异常，同时又获得了1个或多个基因异常。
　　3.Notch2在成人AML患者中的表达、意义及其功能的初步探讨
　　（1）AML患者中Notch2基因 mRNA的表达水平AML患者中Notch2基因 mRNA的表达水平高于正常对照组（P＜0.05）及ALL组（P=0.180）。根据FAB分型分组发现，M3患者的Notch2基因mRNA的相对表达量为0.07494，而其他组表达量中位值0.04637（P=0.174）。根据染色体核型分组发现，伴有t(15,17)核型组和伴有11q23/MLL组的Notch2表达量分别为0.07494和0.06200，其他核型组表达量中位值为0.04762（P=0.22）。
　　（2）Notch2 mRNA表达量与预后的关系Kaplan-Meier分析发现，正常核型AML患者中Notch2基因 mRNA高表达组（相对表达量≥0.04）的2年DFS高于低表达组（相对表达量＜0.04）（2年DFS分别为51％和17％，P=0.047）。而低表达组和高表达组患者的2年OS差异不显著，分别为38％和63％（P=0.528）。在其他中危核型患者中，Notch2基因mRNA表达量与预后无显著关联（P＞0.05）。
　　（3）过表达 Notch2能使白血病细胞株 THP-1的生长和集落形成能力下降，但是沉默该基因的表达，对其生长增殖未造成显著影响。
　　【结论】
　　1.处于缓解期和体能状态较好的rAML患者在allo-HSCT后，能取得更好的预后。对于移植前处于缓解状态的 rAML患者，细胞/分子遗传学以及体能状态对移植结果有显著影响。
　　2.AML患者初诊和异基因造血干细胞移植后复发时，推测基因突变类型可能发生了3种演变模式。初诊时多见涉及信号通路及DNA甲基化调控的基因突变，复发时新出现的基因异常却多见于染色质修饰基因和抑癌基因。
　　3. AML患者中均表达Notch2，在正常核型患者中用荧光实时定量检测Notch2基因mRNA表达水平有一定的提示预后的价值。过表达Notch2在一定程度上能抑制白血病细胞株THP-1增殖，而沉默该基因对细胞株生长影响不显著。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一部分异基因造血干细胞移植治疗难治复发急性髓细胞白血病

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分异基因造血干细胞移植治疗难治复发急性髓细胞白血病后复发克隆演变的初步研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 NOTCH2基因在急性髓细胞白血病中的初步研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:难治复发急性髓细胞白血病治疗进展

英文缩略词表

攻读学位期间发表的文章和参加的学术活动

致谢