HMGB1在人支气管上皮细胞炎症反应中的作用及其在肺癌转移及预后中的作用机制研究

摘要

第一部分 HMGB1通过RAGE/NF-B通路参与人支气管上皮细胞的炎症反应
　　实验目的：非小细胞肺癌(NSCLC)是全世界范围内癌症相关死亡的主要原因。大量证据表明，人正常支气管上皮细胞(NHBE)的炎症微环境能导致非小细胞肺癌的发生、发展。细胞外高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)能参与到导致非小细胞肺癌(NSCLC)癌前病变的炎症反应中。然而，HMGB-1在人正常支气管上皮细胞的炎症反应中的作用和它潜在的机制仍不清楚。
　　实验方法：为了筛选HMGB-1的最佳作用时间，用10?g/ml的HMGB-1处理细胞0、12、24、48和72h后检测炎症相关的NF-?B的活性和炎症细胞因子IL-10的水平。分析HMGB-1是否能通过NHBE细胞表面的RAGE诱导NF-?B的活化，用5?g/ml的RAGE抗体(RAGE-Ab)阻止HMGB-1的刺激。采用10?M JNK抑制剂SP600125阻断JNK的活性，分析HMGB-1是否能通过JNK信号通路诱导NF-?B的活化。采用免疫荧光技术分析检测细胞内生成的活性氧以及 RAGE蛋白的表达情况。采用ELISA实验检测NHBE细胞上清液中的炎症细胞因子TNF-?、IL-8、IL-10和MCP-1的水平。采用免疫印迹分析检测HMGB-1对RAGE的蛋白表达以及对JNK和NF-?B的活化的影响。
　　结果：分别用2.5、5和10μg/ml的HMGB-1刺激NHBE细胞，发现HMGB-1能通过激活RAGE/NF-?B通路诱导NHBE细胞的炎症反应。然而,用5μg/ml的晚期糖基化终末产物（RAGE）受体阻滞剂RAGEAb或者10?g/ml的c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125可以抑制HMGB1诱导的成剂量依赖性释放的炎症因子如TNF-?、IL-8、IL-10和MCP-1的表达。此外，免疫印迹分析显示RAGE抗体预处理后能降低HMGB1诱导RAGE蛋白的表达并且减弱JNK和NF-κB的活性，JNK抑制剂SP600125预处理后能降低HMGB1诱导的JNK和NF-κB的活性。
　　结论：我们的实验结果说明HMGB-1在NHBE细胞中能通过RAGE/JNK/NF-κB信号通路诱导炎症反应。HMGB-1可以作为炎症导致的NHBE向NSCLC癌前病变转变的一个新的治疗靶点。
　　第二部分 HMGB-1通过NF-κB依赖的MMP-2途径促进肺癌细胞的转移而且可以作为肺癌潜在的预后指标
　　实验目的：越来越多的证据表明，HMGB1在癌症进程中发挥关键作用。我们的研究表明，HMGB1能诱导NHBE细胞的炎症反应，它可能作为炎症导致的非小细胞肺癌癌前病变的治疗靶点。然而，HMGB1在肺癌中的表达状态以及其与肺癌临床病理特征的相关性还没有研究透彻。此外，HMGB1在肺癌中潜在的分子机制仍然不是很清楚。本研究旨在探讨HMGB1在肺癌临床病理和预后的意义以及HMGB1在肺癌发生和发展中的潜在价值。
　　实验方法：为了确定在人类肺癌中HMGB1表达是否改变，采用免疫组织化学染色法对组织芯片进行染色，评估肺癌组织和配对相邻肿瘤的组织中HMGB1的表达。为了进一步研究HMGB1染色是否与肺癌患者预后相关，采用kaplan-meier生存曲线评估5年总体生存率与HMGB1染色深浅的关系。为了研究HMGB1是否与肺癌的迁移和侵袭有关，我们通过 transwell实验检测 HMGB1对肺癌细胞侵袭的影响。为了探讨HMGB1在肺癌细胞迁移和侵袭中的调节机制，我们采用免疫印迹和明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶在肺癌细胞中蛋白质的水平和活性。为了确认是否 HMGB1激活的 NF-?B能引起 MMP-2的上调，采用免疫印迹分析来观察人肺癌细胞中 p65和MMP-2的表达。
　　结果：组织芯片包含90例人肺癌组织与配对邻近肿瘤组织，与配对邻近肿瘤组织相比较，我们观察到HMGB1在肿瘤组织有51例表达(56.7％)(P<0.05)。免疫芯片癌组织的中 HMGB1的表达与临床病理的一些特性相关，如 T分期(P=0.027)、淋巴结转移(P=0.019)、TNM分期(P=0.012)。在侵袭实验中,我们发现HMGB1显著提高穿过transwell小室的能力。我们采用免疫印迹和明胶酶谱实验检测MMP-2蛋白质表达水平和活性。我们的数据表明，人肺癌细胞中的HMGB1能够上调MMP-2的表达。而且，干扰p65的表达后能抑制HMGB1诱导的MMP-2蛋白的表达水平。
　　结论：我们的数据表明HMGB1的表达与肺癌进展显著相关。同时，我们也证明HMGB1能通过NF-?B依赖的途径上调并活化MMP-2的表达，从而促进肺癌浸润和转移。这些数据表明HMGB1可能是肺癌一种潜在的预后和治疗的靶点。

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前言

第一部分 HMGB1通过RAGE/NF-?B通路参与人支气管上皮细胞的炎症反应

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 HMGB1通过NF-κB依赖的MMP-2途径促进肺癌细胞的转移并可以作为肺癌潜在的预后指标

材料与方法

结果

讨论

结论

全文结论及展望

一、结论

二、展望

参考文献

综述: HMGB1在炎症与肿瘤中的研究进展

附录

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