胶原膜负载CBD-bFGF修复大鼠外伤性鼓膜穿孔

摘要

背景：胶原是人体细胞外基质的主要结构蛋白，已经被研究作为鼓膜再生的支架材料。碱性成纤维生长因子（bFGF）是一种多潜能的生长因子，它可以促进多种细胞和组织的分化和增殖。研究发现bFGF能加速鼓膜穿孔的愈合。为了结合胶原材料与bFGF双方面的优势，并寻找到一种更合适的修复鼓膜穿孔的方法，我们使用一种人工修饰的bFGF，在其末端添加了一个胶原蛋白结合结构域（CBD），使其与胶原膜（CM）特定地结合，研究两者结合使用对大鼠外伤性鼓膜穿孔的修复作用。
　　方法：（1）体外实验部分：与商品化bFGF作对照，采用CCK-8方法，检测CBD-bFGF促进人皮肤成纤维细胞（HS-865）的增殖作用。然后将CBD-bFGF与胶原膜藕连，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质含量从而评估细胞因子与胶原膜的结合效率。（2）体内实验部分：72只SD大鼠双耳外伤性鼓膜穿孔后按修复材料分为三个实验组，分别为CM-CBD-bFGF干预组（n=24），CM干预组（n=24），对照组（未修复）（n=24）。另8只大鼠未穿孔未修复为假手术组。每个实验组中有8只大鼠分别于术后7天、14天和28天时进行评估。通过显微镜大体观察鼓膜愈合的情况，通过HE染色、Masson染色、免疫组织化学技术和透射电子显微镜检查评估再生鼓膜的组织结构，通过听性脑干反应评估术后听力功能。
　　结果：（1）体外的实验结果显示CBD-bFGF明显促进人皮肤成纤维细胞（HS-865）的增殖，与bFGF相比，存在统计学差异（P<0.01）。CBD-bFGF与胶原膜的结合率为（81.9±11.64％）比bFGF与胶原膜的结合率（72.3±12.01%）高，并且差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）体内实验结果：显微镜检查发现CM-CBD-bFGF组早期的鼓膜愈合率明显高于CM组和空白组，且再生鼓膜外观与正常鼓膜相近。组织学检查发现CM-CBD-bFGF组显示了排列良好的三层组织结构（上皮组织层、纤维组织层和粘膜层）。在观察后期，中间纤维组织层更紧实，胶原纤维排列更规则，与正常鼓膜相近。CM组的再生鼓膜中间纤维组织层疏松、不成熟。而空白组特别菲薄，由于中间纤维组织层不明显。听性脑干反应显示CM-CBD-bFGF组早期听力恢复明显优于CM组和空白组。
　　结论：利用胶原蛋白结合结构域（CBD），CBD-bFGF可高效地结合在胶原膜上。CM-CBD-bFGF可以显著地促进鼓膜组织结构和功能地早期恢复，胶原材料联合CBD-bFGF对于外伤性鼓膜穿孔的修复效果显著，在临床上具有潜在的应用前景。