骨髓间充质干细胞与软骨细胞聚集共培养修复兔膝关节骨软骨缺损的研究

摘要

一、体外骨髓间充质干细胞与软骨细胞聚集共培养体系的建立
　　目的：探索骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）与软骨细胞（Articular Chontrocytes，ACs）在体外通过离心聚集构建的共培养体系下，其分化为ACs的能力。
　　方法：4周龄新西兰大白兔幼兔在无菌环境下，取其骨髓和软骨，通过分离、贴壁培养、传代BMSCs和ACs。利用流式细胞仪测CD44、CD31对BMSCs进行鉴定，利用阿利新蓝染色、番红花O-亮绿染色及Ⅱ型胶原染色免疫组化染色对ACs进行鉴定。ACs和BMSCs按1:3的比例混合为CO组，细胞总数为4×107，在500g离心力下离心5分钟，聚集共培养于15ml离心管内。另取等量的ACs为AC组，以上述方法培养于离心管内作对比研究。隔日换液，收集细胞培养上清液，利用阿利新蓝比色法定量检测细胞糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）含量，酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)定量检测Ⅱ型胶原含量。
　　结果：经鉴定获取的BMSCs CD44(+)、CD31(-);ACs阿利新蓝、番红花O-亮绿及Ⅱ型胶原染色免疫组化染色均阳性。利用贴壁培养传代可获取满意纯度BMSCs和ACs。CO组与AC组离心管内聚集共培养三周，检测分泌的GAG含量和Ⅱ型胶原含量无差异（P>0.05）；至第四周末检测分泌的GAG含量和Ⅱ型胶原含量有差异（P<0.05）。
　　结论：BMSCs和ACs通过离心管内聚集共培养可诱导BMSCs分化为ACs。
　　二、体内骨髓间充质干细胞与软骨细胞聚集修复兔膝关节骨软骨缺损
　　目的：研究利用BMSCs和ACs离心管内聚集共培养构建无支架细胞团修复兔膝关节骨软骨缺损的能力。比较细胞共培养体系与ACs、BMSCs及空白体内修复骨软骨缺损的能力。
　　方法：构建兔膝关节骨软骨缺损模型，以手摇钻在兔膝关节双侧股骨髁间凹制造直径4mm的骨软骨缺损。将ACs和BMSCs分别染以细胞膜荧光染色剂PKH-67和PKH-26后，以1:3的比例混合，细胞总数为4×107，于15ml离心管内500g离心5分钟成团。再分别以等量BMSCs和ACs以上述方式处理制成的细胞团。用这三组细胞团分别修复兔膝关节骨软骨缺损。另留取一组关节缺损不修复，作为空白组。共四个处理组：共培养修复组（CO组）、ACs修复组（AC组）、BMSCs修复组（BMSC组）、空白组（Empty组）。每个组样本量18只兔36膝。在兔体内修复关节骨软骨缺损后分别在4周、8周、12周三个时间点各取每组12个样本，取出关节后，按照Cook's评分系统进行关节修复情况的大体评价。各样本取样切片，进行组织细胞学观察（冰冻切片观察细胞荧光、HE染色观察修复组织细胞形态、番红花O染色观察软骨细胞分泌GAG的能力、Ⅱ型胶原免疫组化染色观察ACs分泌Ⅱ型胶原的能力），并按Wakitani's组织学评分系统进行评分。
　　结果：各组兔膝关节骨软骨缺损得到不同程度修复，CO组和AC组修复外观优于BMSC组和Empty组，Cook's评分结果有统计学意义（p<0.05），CO组与AC组的Cook's评分结果无统计学意义（p>0.05）。12周冰冻切片荧光显示BMSCs和ACs共同参与了骨软骨的修复，但单纯BMSC组中外源BMSCs参与修复骨软骨的能力有限。各时间点CO组和AC组的骨软骨缺损由透明软骨细胞或纤维软骨细胞修复，软骨细胞外基质分泌丰富；BMSC组和Empty组的骨软骨缺损由纤维组织修复，缺乏软骨细胞外基质。CO组和AC组的Wakitani's组织学评分与BMSC组和Empty组的差异有统计学意义（p<0.05）。CO组与AC组的Wakitani's组织学评分差异无统计学意义（p>0.05）。
　　结论：
　　1、可利用离心管内聚集共培养技术制作无支架细胞团修复兔膝关节骨软骨缺损。
　　2、体内BMSCs可被ACs诱导分化为软骨细胞并参与修复骨软骨缺损，BMSCs修复骨软骨的能力有限。
　　3、BMSCs和ACs聚集成团共培养体系无支架修复兔膝关节骨软骨缺损的能力不弱于全软骨细胞团，可替代全软骨以节约软骨细胞的使用。