负载乙酰半胱氨酸(NAC)的丝素基生物活性骨水泥椎体强化的应用评价及其促成骨机制研究

摘要

第一部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥的制备及理化性能表征
　　目的：将N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）载入SF/CPC体系，制备负载NAC的丝素（SF）基磷酸三钙（α-TCP）生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP），并对其理化性能进行表征。
　　方法：向含6％的丝素溶液中加入10mM和25mM不同浓度的NAC配制骨水泥固化液，该固化液与α-TCP粉末以液固比0.4ml：1g混合制备NAC/SF/α-TCP骨水泥。采用吉尔摩双针法测定骨水泥凝固时间；力学测试仪测试骨水泥凝固后抗压强度；观察其在 PBS中的抗溃散性；X线衍射分析其晶体成分，扫描电镜观察骨水泥凝固后其表面形貌。
　　结果：向含6%的丝素溶液固化液中加入25mM的NAC后，初凝时间为21.77±1.07（min），终凝时间为31.88±1.69（min），比α-TCP骨水泥的初凝时间58.67±1.185（min）和终凝时间77.38±2.45（min）明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；骨水泥的抗压强度为49.39±1.68（MPa），比α-TCP骨水泥抗压强度13.60±3.31（MPa）和SF/α-TCP组抗压强度29.86±4.17（MPa）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；NAC/SF/α-TCP和SF/α-TCP加入PBS后观察12小时仍未发生明显溃散，而α-TCP骨水泥加入PBS中，即刻发生溃散；XRD显示NAC/SF/α-TCP骨水泥固化后主要成分是羟基磷灰石（HA）；扫描电镜显示NAC/SF/α-TCP比α-TCP骨水泥表面可见更多取向一致的致密团簇状HA结晶。
　　结论：成功制备的负载25mM NAC的生物活性丝素蛋白磷酸钙骨水泥（NAC/SF/α-TCP）可明显提高SF/α-TCP的抗压强度。
　　第二部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥体外增强椎体生物力学研究
　　目的：研究负载NAC的丝素（SF）基磷酸三钙（α-TCP）生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP）对骨缺损椎体的强化作用，并与最常用的椎体强化材料PMMA以及项目组既往研制的丝素基磷酸三钙骨水泥进行比较，来评价此生物活性骨水泥在椎体成形术或后凸成形术中用来强化椎体的应用前景。
　　方法：取35个绵羊椎体，随机分成5组，每组7椎。以直径为6.0mm钻头垂直椎体矢状面横向钻通椎体双侧皮质，制作椎体骨缺损模型；向此椎体骨缺损模型中填充PMMA、SF/α-TCP、NAC/SF/α-TCP骨水泥，对填充骨水泥的椎体进行生物力学测试，并与正常椎体及空白骨缺损模型比较椎体强度和刚度。
　　结果：各组椎体骨缺损区骨水泥注入顺利。生物力学测试结果显示各骨水泥组椎体均得到了增强。PMMA组抗压强度最高，达3455±911.5（N），其次为NAC/SF/α-TCP组和正常椎体组强度，空白对照组强度最低，为1859±479.3（N）。NAC/SF/α-TCP组与正常椎体组和PMMA组相比无显著性差异。注入骨水泥后各组椎体刚度得到不同程度的升高。NAC/SF/α-TCP和 PMMA组刚度与空白对照组相比显著增强，分别为1951±265.4（N/m）（P=0.0008）和2154±347.4.1（N/m）（P＜0.001）。相对于SF/α-TCP组，NAC/SF/α-TCP组在恢复椎体刚度的能力上略高，几乎与 PMMA相当，但仍都低于正常椎体组。
　　结论：负载NAC的丝素基生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP），经生物力学测试显示其体外强化椎体可明显提高椎体的强度和刚度，可能在VP或KP中具有一定的应用前景。
　　第三部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥修复骨缺损的体内研究
　　目的：探讨负载NAC的丝素基磷酸三钙生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP）修复骨缺损的效果，分析骨水泥在体内与松质骨的结合、材料周围新骨生成和材料剩余情况。
　　方法：40只SD大鼠，在双侧股骨髁距股骨下端关节面3.0mm处垂直股骨矢状面制作直径3.5mm深0.5mm骨缺损，分别填入调制好的NAC/SF/α-TCP和SF/α-TCP两种骨水泥或留作空白对照。4周和8周的股骨三点弯曲试验观察各样本骨缺损区抗弯曲强度，Micro-CT和HE染色观察骨水泥填充骨缺损4周和8周后周围的新骨生成和骨水泥降解情况。Lane-Sandhu影像学和组织学评分评价两种骨水泥植入4周和8周后骨水泥与松质骨结合情况。
　　结果：骨缺损区骨水泥注入顺利，三点弯曲试验结果显示空白对照组、SF/α-TCP和NAC/SF/α-TCP组的抗弯曲强度随着时间推移呈逐渐增高趋势，但总低于正常对照组。Micro-CT扫描和HE染色显示骨水泥植入体内4周后周围开始有新生骨形成，骨水泥部分降解；8周时NAC/SF/α-TCP组周围新生骨明显较SF/α-TCP组增多（P＜0.05），骨小梁向骨水泥中渗入，NAC/SF/α-TCP残留也少于SF/α-TCP（P＜0.05）。4周和8周NAC/SF/α-TCP组Lane-Sandhu影像学和组织学评分均明显高于SF/α-TCP（P＜0.05）
　　结论：负载NAC的丝素基生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP），经体内修复大鼠股骨远端骨缺损的体内观察研究表明，相对于 SF/α-TCP，其具有较好的成骨能力，能促进骨水泥材料周围新生骨的生成。
　　第四部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥促成骨机制研究
　　目的：探讨负载 NAC生物活性骨水泥（NAC/SF/α-TCP）促进成骨分化作用，及其促进成骨细胞分化的相关信号通路，揭示NAC/SF/α-TCP促成骨作用的相关机制。
　　方法：取NAC/SF/α-TCP和SF/α-TCP材料的浸提液，与成骨细胞系MC3T3-E1细胞株，在成骨诱导条件下分别培养一定的时间后，行 ALP活性检测和茜素红染色观察成骨细胞分化情况，实时定量RT-PCR和Western Blot法检测Runx2、Osterix、β-catenin和OCN等成骨相关基因的表达。在成骨细胞培养基中加入DKK1后观察成骨细胞分化和上述各蛋白的表达量变化情况。
　　结果：NAC组（NAC/SF/α-TCP浸提液）与细胞培养3天后ALP活性较对照组（Control组）明显升高（P＜0.05）；21天后茜素红染色可见NAC组较Control组和SF/α-TCP组明显红染。Western Blot和不同时间点的RT-PCR结果显示NAC组成骨细胞Runx2、Osterix、β-catenin和OCN较对照组和SF/α-TCP组表达增高；在3天和7天时RT-PCR显示NAC组与对照组和SF/α-TCP组之间的Runx2、Osterix、β-catenin和OCN的表达都存在显著性差异（P＜0.05）。在培养基中加入DKK1，培养3天后成骨细胞的Runx2、Osterix、β-catenin和OCN的表达均出现明显下降（P＜0.05）；培养3天后成骨细胞的ALP活性相对降低（P＜0.05）；茜素红染色也明显减弱。
　　结论：NAC/SF/α-TCP在体外可以促进成骨细胞分化，其可能的机制是通过活化Wnt/β-catenin信号通路来实现。

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前言

1.骨质疏松性椎体骨折流行病学

2.骨质疏松椎体骨折治疗现状

3.椎体内充填材料研究现状

4.本研究的主要内容及意义

参考文献

第一部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥的制备及理化性能表征

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥体外增强椎体生物力学研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥修复骨缺损的体内研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分负载NAC丝素基生物活性骨水泥促成骨机制研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述:可注射性生物活性骨水泥的研究进展

英文缩略词表

攻读博士学位期间科研情况

致谢

后记