长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建

摘要

【目的】
　　1、探究与正常人相比，LLEST在急性髓系白血病（AML）及骨髓增生异常综合征（MDS）中表达情况，明确LLEST在AML中的重要意义。
　　2、研究LLEST促进凋亡机制。
　　3、构建携带LLEST基因的慢病毒载体，初步进行慢病毒包装，并检验其有效性，为下一步探究LLEST在原代白血病细胞上的效应与功能提供理论与实验基础。
　　【方法】
　　通过对NCBI数据库中大样本基因芯片数据的分析，发现与正常人相比，LLEST表达在AML和MDS患者中水平较低。选择前期实验建立的高表达LLEST的K562细胞株（LLEST细胞株）和对照组K562细胞株（Vector细胞株）为实验对象，以基因芯片技术检测两种细胞株表达有差异的基因，同时运用生物信息学分析软件预测LLEST可能作用的基因。基于对BCL2基因的预测，选择4例AML患者治疗前后的标本、LLEST细胞株和Vector细胞株、LLEST细胞和Vector细胞裸鼠皮下成瘤实验所成的瘤块进行研究相关基因及蛋白表达水平进行研究。应用双荧光素酶报告基因技术对 LLEST促凋亡机制进行深入探索。基于对 XIAP基因的预测，选择18例初治AML治疗前后的骨髓标本以及LLEST细胞株和Vector细胞株，对LLEST和XIAP基因的表达进行初步研究。选择LV5慢病毒质粒为载体，构建携带LLEST基因慢病毒质粒，并初步进行慢病毒的包装，为下一步研究奠定基础。
　　【结果】
　　1、根据NCBI数据库Haferlach等对AML及MDS研究的基因芯片数据，经过分析发现，与正常人相比，LLEST在AML及MDS患者中的骨髓单个核细胞的表达水平下降。
　　2、为了分析 LLEST发挥作用的机制，首先通过基因芯片技术检测到在 LLEST细胞株及Vector细胞株中表达有差异的基因，共1613个；通过生物信息软件预测了LLEST可能作用的基因，共1518个，同时存在于这两个数据集中共有11个基因。选择4例AML患者治疗前后的骨髓标本对这11个基因及LLEST进行检测，预测的基因只有BCL2基因水平一致性降低，LLEST明显升高。在LLEST细胞株和Vector细胞株中，BCL2基因的表达有明显差异，LLEST细胞株的BCL2基因明显低水平。在裸鼠成瘤组织中，LLEST细胞皮下成瘤组织中，BCL2蛋白明显比对照组表达低。
　　荧光素酶基因实验表明LLEST对BCL2基因有直接抑制作用。
　　3、18例AML患者中，有4例患者治疗后骨髓标本LLEST和XIAP水平同时降低。LLEST细胞株相较于Vector细胞株XIAP表达水平也明显较低。
　　4、选择 LV5慢病毒质粒为载体，成功构建了携带LLEST基因的重组慢病毒质粒 LV5-LLEST，在293T细胞中完成慢病毒的包装，并转染 K562细胞。经 Q-PCR证实K562细胞实现了LLEST的高表达，结果表明重组质粒构建的有效性。
　　【结论】
　　1、AML与MDS病人中LLEST表达存在明显差异。
　　2、LLEST对白血病细胞具有促凋亡作用，通过下调BCL2基因而介导。3、XIAP参与LLEST发挥促凋亡作用，但其机制尚需进一步研究。
　　4、成功构建携带LLEST基因的慢病毒载体，并初步完成了慢病毒的包装，为下一步探究LLEST在原代白血病细胞上的效应与功能提供理论与实验基础。

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引言

第一部分 长链非编码RNA-LLEST抗白血病机制的研究

材料与方法

结果

第二部分 LLEST抗白血病机制与XIAP

材料与方法

结果

第三部分 携带长链非编码RNA-LLEST基因慢病毒质粒的构建

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述;凋亡抑制蛋白XIAP在白血病中的研究进展

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