高表达SERCA2a在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护机制

摘要

目的：
　　研究提高心肌肌浆网钙离子ATP酶（Sarcoplasmic reticulumCa2+-ATPase，SERCA2a）的表达在大鼠心肌缺血/再灌注（Myocardial ischemia-reperfusion,I/R）损伤中的保护作用及可能机制。
　　方法：
　　通过对Wistar大鼠受精卵原核内微量注入携带有SERCA2a cDNA的质粒PCAGGS-CCI，建立SERCA2a转基因大鼠系。通过开胸结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支30 min，再灌注24 h制备心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）模型。设立组别分别为野生型对照组（WT）、野生型I/R组(WT+I/R)、转基因型对照组（TG）、转基因型I/R组（TG+I/R）。采用心功能分析系统检测心室压、动脉压等各项指标；随后取出心脏，采用Evans blue-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色法测定心肌组织梗死面积和缺血面积；经HE染色，观察I/R之后各组的病理变化；Western blot检测心肌组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B-II/LC3B-I的表达及变化。
　　结果：
　　1.心功能指标
　　心功能分析数据显示，麻醉状态下，TG组和WT组大鼠心功能虽然存在着差异，但均在正常范围，经过I/R处理之后，TG组心功能指标下降明显低于W T组心功能下降（P<0.05）。
　　2. I/R之后缺血面积与梗死面积的比较
　　TTC染色显示，野生型和转基因型大鼠心脏左冠状动脉前降支结扎30 min再灌注24 h后，心肌组织缺血面积与左心室横切面比值的平均值WT+I/R组与TG+I/R组并无显著性差异（P>0.05）；梗死面积（infarction area）与缺血面积（isc he mia a rea）比值的平均值TG+I/R组显著低于WT+I/R组（P<0.05），即在在结扎位置大体一致保证缺血面积相同的情况下由缺血再灌注诱导的心肌组织损伤，WT型大鼠显著高于TG型大鼠。
　　3.各组I/R后的心肌病理变化
　　HE染色结果显示，对照组的心肌纤维排列规则，心肌间未见异常。W T+I/R组胞质疏松、细胞间质空隙增大提示间质水肿且有炎性细胞浸润。而TG+I/R组则心肌纤维排列相对规则，炎症细胞浸润相对较少。
　　4.凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白
　　野生型与转基因型大鼠I/R后凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的表达情况表明，生理状态下，TG组大鼠心肌组织中抗凋亡的 Bcl-2表达显著低于 WT组大鼠（P<0.05），经过I/R处理之后，TG组大鼠Bcl-2表达显著增加（P<0.05），而WT组大鼠Bc l-2表达的变化不显著（P>0.05）。而促凋亡蛋白Ba x的表达在生理状态下，WT和TG组相比较差别不显著（P>0.05），但缺血30 min再灌注24 h后TG组Bax的表达与TG对照组相比显著下降（P<0.05）并且显著低于WT+I/R组（P<0.05）。而Bcl-2/Bax的值则显示在WT和TG型大鼠中，I/R处理组与相应的对照组相比均升高，但仅TG+I/R组具有显著性差异（P<0.05），且比WT+I/R组升高的更加明显（P<0.05）。在生理状态下LC3B-II/LC3B-I的值在WT和 TG型大鼠心脏中表达无显著差异（P>0.05），I/R之后TG+I/R组的LC3 B-II与LC3B-I的比值明显高于 TG对照组（P<0.05）并且显著高于 WT+I/R组（P<0.05）。而Bec lin-1的表达在各组间并无显著性差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1.缺血再灌注引起的心肌损伤 TG型大鼠显著低于 W T型大鼠，即高表达SERC A2a对受损心肌具有保护作用。
　　2.该保护作用的可能机制是缺血再灌注之后TG大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Ba x的下降和抗凋亡蛋白 Bc l-2的升高以及 TG大鼠高表达的自噬相关蛋白引起的。

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引言

实验材料与方法

一、实验材料

（一）实验对象

（二）实验仪器

（三）主要试剂

二、实验方法

（一）实验动物分组

（二）建立SERC A2a转基因大鼠系

（三）SERC A2a转基因大鼠的鉴定1． 总DNA的提取

（四）心肌缺血再灌注模型的建立

（五）心功能指标的测定

（六）心肌缺血面积和梗死面积的评估

（七）Western blot分析Bcl-2、Bax、Beclin-1和LC3B-II/LC3B-I

（八）图像采集与分析

（九）心肌苏木精-伊红（HE）染色

（十）统计学分析

实验结果

一、转基因大鼠系的特性

二、心功能指标比较

三、缺血面积和梗死面积的比例

四、各组I/R后的心肌病理变化

五、抗凋亡和促凋亡蛋白

六、自噬相关蛋白

讨论

结论和展望

结论：

展望：

参考文献

综述：钙离子在心肌缺血再灌注中的作用机制

缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

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