NBN基因3’非翻译区遗传变异与胃癌易感性的关联研究

摘要

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其年龄标化发病率和死亡率分别居我国恶性肿瘤的第2位和第3位，严重威胁着我国居民的生命健康。胃癌的发生是一个长期多阶段的过程，是环境因素与遗传因素复杂相互共同作用的结果。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）是个体间遗传差异的主要形式。探索基因组中 SNPs与胃癌易感性的关联，阐明胃癌的遗传易感机制，筛检具有胃癌遗传易感性的高危人群，并采取针对性的预防措施，是有效控制胃癌疾病负担的策略之一。
　　基因组不稳定是肿瘤的重要特点，DNA的化学结构频繁受到各种外源及内源性毒理因子的攻击，改变遗传信息的高保真传递过程，破坏基因组的稳定性，最终导致癌前病变或癌症的发生。在各种DNA损伤中，DNA双链断裂（Double-strand breaks，DSBs）是最为严重的一种，它可以触发细胞永久性的生长停滞或细胞死亡。DNA修复是一系列与恢复正常DNA序列结构和维持遗传信息相对稳定有关的细胞反应。许多基因产物参与了DSBs修复过程，NBN是MRN（MRE11/RAD50/NBN）复合物中的重要成分，是DSBs修复中最重要的一个参与者。研究发现，NBN基因突变会诱发Nijmegen断裂综合征（Nijmegen breakage syndrome，NBS），此病是一种少见的常染色体隐性遗传病，其显著特征是患者具有严重的免疫缺陷，患者的细胞对电离辐射非常敏感，并表现出染色体脆性升高和细胞周期检控点调控异常等特征，极易患多种肿瘤。并且研究认为NBN基因多态性也会导致蛋白结构的微妙改变，产生个体对肿瘤易感性的差异。
　　在这项研究中，我们假设 NBN基因的遗传变异在胃癌的遗传易感性中发挥重要作用。
　　研究目的：探讨 NBN基因3’非翻译区潜在的功能性单核苷酸多态性位点遗传变异与胃癌易感性之间的关联情况。
　　研究方法：1、病例-对照研究标本：采用病例-对照设计，在中国人群中进行1,140例胃癌和1,547例对照的大样本关联研究，病例为江苏地区医院来源的1,140例新发胃癌病例，对照样本为来源于江苏地区社区慢病筛查人群的1,547例健康个体。
　　2、SNP位点选择：根据 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)以及国际人类基因组单体型图计划数据库（http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/），并基于以下两个标准：1）位于外显子，3’或5’端未翻译区，和2）在中国人群中的最小等位基因频率不小于10％，基因分型率大于95%。筛选出10个NBN基因 SNPs，再应用连锁不平衡分析（LD）r2=0.80的阈值进一步筛选这些 SNPs。最终选中4个标签 SNPs，包括 rs10464867（G>A），rs14448（A>G），rs1063053（G>A）和 rs1063045（G>A）。
　　3、基因分型及关联分析：采用 TaqMan基因分型方法检测并分析了 NBN基因SNPs rs10464867，rs14448，rs1063053，rs1063045与胃癌发病风险的关联。采用χ2检验或 t检验比较人口学特征、NBN基因4个多态位点基因型频率在病例组和对照组间的分布；采用 Logistic回归模型，调整了年龄、性别、吸烟和饮酒等因素分析 NBN基因各 SNP位点与中国人群胃癌遗传易感性之间风险关联强度，计算 OR值、95%可信区间和 P值；研究以年龄、性别、吸烟和饮酒情况进行分层分析，采用基于卡方分布的 Q检验评估了各亚组之间的异质性，并进行基因-环境交互作用分析；构建单倍型进一步分析单倍型与胃癌易感性之间的关联。
　　4、生物信息学功能预测和分析：根据 RegulomeDB、UCSC、HaploReg和GTEx数据库进行 NBN基因生物信息学功能的预测和分析，并基于 TCGA数据库 RNA-Seq的表达数据分析胃腺癌组织及癌旁组织中 NBN mRNA的表达情况，初步推测 NBN基因在胃癌发生中潜在存在的生物学功能。
　　研究结果：1、NBN基因多态性位点 rs10464867（G>A）A等位基因与降低的胃癌风险显著相关（相加模型，OR=0.81,95%CI=0.71-0.94; P=0.005），可以显著降低约20%的胃癌发病风险；未发现多态性位点 rs14448、rs1063045、rs1063053与胃癌发病风险之间有显著关联。
　　2、以年龄、性别、吸烟、饮酒情况进行分层分析，发现携带 rs10464867A和 rs14448G等位基因者在高龄组可以显著降低胃癌患病风险（rs10464867：相加模型，调整 OR=0.72,95%CI=0.59-0.88，P=0.001；rs14448：相加模型，调整 OR=0.84,95%CI=0.71-1.00，P=0.049），但两个位点与胃癌患病风险在年龄亚组间无明显差异（异质性检验 rs10464867：P=0.115；rs14448：P=0.439）；携带 rs10464867A和 rs14448G等位基因在男性中可以显著降低胃癌患病风险（rs10464867：相加模型，调整 OR=0.73,95%CI=0.62-0.87，P=3.70×10-4；rs14448：相加模型，调整 OR=0.81,95%CI=0.70-0.94，P=0.006），两个位点与胃癌患病风险的关联在性别亚组间存在异质性（异质性检验均为P=0.041）。携带rs1063053 A和rs1046045A等位基因在吸烟组可以显著降低胃癌患病风险（rs1063053：相加模型，调整 OR=0.82,95%CI=0.69-0.97，P=0.019；rs1063045：相加模型，调整 OR=0.80,95%CI=0.68-0.94，P=8.21×10-3），两位点与胃癌风险的关联在吸烟与否的两个组间存在差异（异质性检验 rs1063053：P=0.033；rs1063045：P=0.022）。
　　3、通过交互作用分析，我们发现 rs10464867和 rs14448与性别均在胃癌发病危险中存在显著的交互作用（交互作用rs10464867：P=0.033；rs14448：P=0.031）；rs1063053和rs1063045与吸烟状况也在胃癌的发病风险中存在显著的交互作用（交互作用rs1063053：P=0.033；rs1063045：P=0.017）。
　　4、进一步将 NBN基因的 SNPs位点 rs10464867（G>A）、rs14448（A>G）、rs1063053（G>A）和 rs1063045（G>A）构建单倍型，其中 rs10464867（G>A）、rs14448（A>G）、rs1063053（G>A）位于同一区段内，分析发现相比于 NBN基因的单倍型 Grs10464867Ars14448Grs1063053，Ars10464867Grs14448Grs1063053单倍型体现强的胃癌保护作用（调整 OR=0.76,95%CI=0.65-0.89，P=6.39×10-4）；同样Grs10464867Ars14448Ars1063053单倍型也与降低的胃癌患病风险相关联（调整 OR=0.88,95%CI=0.77-0.99，P=0.034）；我们未发现单倍型 Grs10464867Grs14448Grs1063053与胃癌患病风险之间有显著性关联。
　　5、在GTEx数据库中对与rs10464867高LD的SNP和NBN基因进行eQTL分析，结果发现rs2284135与NBN基因存在eQTL，rs2284135的A等位基因可以显著增加 NBN基因的表达（全血中 beta=0.31，P=0.038），提示 rs10464867可能通过 rs2284135调控 NBN基因的表达从而在胃癌发生发展中发挥生物学功能。
　　6、根据 TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库 RNA-Seq表达数据数据分析也进一步显示 NBNmRNA在胃腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，表明 NBN在胃癌的发生中起重要的作用。
　　研究结论：NBN基因多态性有助于胃癌遗传易感性的研究，有助于我们进一步认识 NBN基因在肿瘤发生发展中的作用，并且这些胃癌易感性 SNPs位点将为筛检胃癌高危人群提供生物标志物。

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声明

中文摘要

英文摘要

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前言

材料与方法

一、研究设计与研究对象

二、研究方法

结果

一、研究对象的一般情况

二、NBN多态性位点的基因型与胃癌易感性关系的研究

三、NBN多态性位点的基因型与胃癌易感性关系的分层分析

四、NBN基因SNPs位点基因型与环境的交互作用分析

五、NBN多态性位点的单倍型与胃癌易感性关系的研究

六、NBN基因生物信息学功能分析

讨论

结论

参考文献

综述: NBN在DNA损伤及稳定性中的作用研究进展

英文缩写词释表

攻读博士学位期间本人公开发表的论文

致谢