人气道胰蛋白酶样蛋白酶4在急性髓细胞性白血病中的研究

摘要

第一章：HATL4在急性髓细胞性白血病中的表达及预后相关性
　　目的：
　　II型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type II transmembrane serine proteases，TTSPs）是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶。人类TTSPs共有17个成员，在生理及病理过程中起着广泛而重要的作用，其功能异常导致癌症、缺铁性贫血、高血压、耳聋等。许多研究证实TTSPs与实体肿瘤的发生发展关系密切。我们实验室对TTSPs在恶性血液疾病中的作用开展了相关研究。
　　基于前期研究结果，我们发现人气道胰蛋白酶样蛋白酶4（Human airway trypsin-like protease4，HATL4）分子在急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）患者骨髓细胞中异常表达。在本研究中，我们以HATL4作为重点研究对象，深入探讨该分子在AML发生发展中的作用及潜在机制，以及成为疾病诊断、预后指标或治疗靶点的可行性。为进一步研究 TTSPs的功能以及它们在血液恶性肿瘤中的作用提供依据，也为 TTSPs在肿瘤中的研究拓宽新的角度和视野。
　　方法：
　　1．收集恶性血液疾病患者骨髓标本，分离骨髓中的白细胞用于以下各种实验。
　　2．利用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription PCR，RT-PCR）和实时定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）对人恶性血液病细胞系和患者骨髓细胞中HATL4 mRNA的表达进行分析。
　　3．采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中HATL4蛋白的表达。
　　4．使用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）和免疫荧光染色检测正常人外周血（Normal peripheral blood，NPB）白细胞和AML细胞系THP-1及AML患者骨髓细胞中HATL4蛋白的表达与定位。
　　5．利用qRT-PCR检测AML患者治疗后骨髓细胞中HATL4 mRNA的表达并分析其与临床参数的相关性。
　　结果：
　　1．HATL4 mRNA在AML来源细胞系（HEL、SHI-1和THP-1）和慢性粒细胞性白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）来源细胞系（KU-812、MEG-01和K562）中表达，而在其它恶性血液病细胞系中不表达。另外，HATL4 mRNA在AML患者骨髓细胞中异常髙表达，而在正常人外周血、骨髓和其他白血病如CML、急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）、CLL（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者骨髓细胞中检测不到。
　　2．Western blotting结果显示HATL4在AML患者骨髓细胞中异常表达，而在其它白血病患者骨髓细胞中未检测到 HATL4蛋白的表达，与 mRNA表达结果一致。
　　3．流式细胞术发现HATL4蛋白表达于AML患者骨髓细胞的粒细胞和单核细胞表面上，阳性率均为100％，不表达于NPB细胞及T或B淋巴细胞表面上。免疫荧光染色证实，HATL4定位于THP-1和AML骨髓细胞的膜表面。
　　4．在105例治疗后AML病人骨髓标本中，HATL4 mRNA阳性19例，阴性86例。基于美国国立综合癌症网络实践指南分级，HATL4表达阳性病人为预后等级差（47.37%）或中等（52.63%），而在表达阴性病人中，小部分（4.65%）是预后等级差，大部分是预后等级中等（69.77%）和良好（25.58%）。在相关性分析中，骨髓细胞HATL4 mRNA表达与患者微小残留病灶（Minimal residual disease，MRD）和预后等级相关，与其他参数如：年龄、性别、亚型等无显著相关性。Kaplan-Meier法分析显示，HATL4阳性病人无进展生存期显著短于阴性病人（p=0.0299）。
　　结论：本章节研究发现，AML初诊患者骨髓细胞高表达HATL4 mRNA和蛋白，提示HATL4可能作为诊断AML新的生物标志物。此外，AML患者治疗后HATL4的表达与 MRD和预后等级相关，HATL4表达水平越高，复发的可能性越大，预后等级越差。此外，HATL4表达阳性的患者无进展生存期明显缩短，预示HATL4阳性病人预后不良。因此，HATL4在 AML患者骨髓细胞中的异常高表达，有望应用于AML的临床早期诊断、靶向治疗及预后评估。
　　第二章：HATL4的肿瘤细胞生物学体外研究
　　目的：在第一章中，我们发现HATL4在AML患者骨髓肿瘤细胞中异常高表达，并且该表达与 AML病人预后不良相关。这些结果提示，HATL4在肿瘤细胞的异常表达可能与AML的病理过程相关。我们推测，HATL4的表达可能影响AML细胞的肿瘤生物学功能，从而参与AML的发生发展。因此，本研究中我们选用了内源性表达 HATL4的急性髓系白血病细胞系 THP-1作为研究对象，通过特异性沉默HATL4 mRNA的表达，在体外水平研究HATL4对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，探讨HATL4在AML细胞生物学中的作用及可能机制。
　　方法：
　　1．构建特异性干扰HATL4的shRNA（Short hairpin RNA）慢病毒载体，利用磷酸钙沉淀法制备慢病毒，侵染AML系THP-1细胞，干扰HATL4 mRNA的表达，用qRT-PCR和Western blotting技术检测慢病毒干扰效率。
　　2．用FCM检测对照组和干扰组中绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的阳性率，以THP-1细胞为阴性对照。
　　3．以构建的HATL4-pcDNA3.1全长基因为模板，采用定点突变，构建HATL4突变体。利用瞬间高压电穿孔细胞膜，将 HATL4突变体转入到已特异性沉默HATL4的细胞中，该突变体不能被shRNA特异性沉默，从而在shRNA干扰后的THP-1细胞中恢复HATL4的表达。
　　4．通过流式分选（Flow sorting），用间接荧光染色法将上述电转化表达HATL4突变体的细胞分选出来。
　　5．利用细胞增殖实验（Cell counting kit-8，CCK-8）检测特异性沉默HATL4 mRNA表达后对THP-1细胞增殖能力的影响。
　　6．采用细胞迁移实验（Transwell migration assay）检测HATL4表达下调后THP-1细胞迁移能力的改变。
　　7．通过基底膜侵袭实验（Transwell Matrigel invasion assay）检测HATL4表达下调后THP-1细胞侵袭能力的改变。另外，在实验中加入基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）抑制剂GM6001，观察HATL4沉默前后THP-1细胞侵袭Matrigel能力的改变。
　　8．收集HATL4沉默前后THP-1细胞的培养上清，通过明胶酶谱法分析HATL4表达水平高低对上清中MMP-2和MMP-9活性的影响。
　　9．转染表达HATL4于中国仓鼠卵（Chinese hamster ovary，CHO）细胞膜上，研究HATL4对重组pro-MMP-2蛋白的活化，用MMP-2活性试剂盒检测上清，以此验证HATL4是否参与pro-MMP-2酶原的激活。
　　结果：
　　1．我们采用siRNA特异性沉默HATL4 mRNA的表达。用含shH（包含特异性沉默HATL4的shRNA核苷酸序列，命名为干扰组）和shNC（以shH序列为靶序列打乱的核苷酸序列，命名为对照组）目的质粒的病毒侵染 THP-1细胞，培养72 h后，经过FCM检测细胞中GFP的阳性率（即病毒侵染效率）大于99%。再经qRT-PCR检测干扰组的HATL4 mRNA表达抑制率大约是70%，因此筛选到两组对照组（shNC1和shNC2）和干扰组（shH1和shH2）细胞。
　　2．将构建的两个HATL4突变体，电转导入两个干扰组细胞（shH1和shH2）中，培养扩大后，间接荧光染色，经流式分选得到HATL4突变体表达阳性细胞（命名为恢复组，shR1和shR2）。然后分别用qRT-PCR和Western blotting检测HATL4 mRNA和蛋白的表达。与对照组（shNC1和shNC2）相比，干扰组（shH1和shH2）细胞中，HATL4 mRNA和蛋白表达抑制率约70%。HATL4突变体重新表达的两个恢复组（shR1和shR2）细胞株中，HATL4 mRNA和蛋白的表达又恢复到对照组水平。结果表明shRNA介导的HATL4沉默是特异的，这些细胞可用于后续的功能学研究。
　　3．细胞增殖实验表明，特异性沉默HATL4表达以及沉默后又恢复HATL4表达对THP-1细胞的增殖能力没有明显改变。
　　4．细胞迁移实验表明，降低HATL4表达对THP-1细胞的迁移能力没有明显改变。
　　5．基底膜侵袭实验表明，抑制HATL4表达后，THP-1肿瘤细胞对Matrigel的侵袭能力显著降低。此外，加入 MMP抑制剂 GM6001明显降低对照组和干扰组细胞侵袭Matrigel的能力，说明HATL4增强THP-1细胞侵袭能力至少在一定程度上是通过MMPs介导的。
　　6．Western blotting结果显示对照组、干扰组和恢复组THP-1细胞上清中pro-MMP-2总量基本相同，但明胶酶谱实验提示，干扰组细胞中活化的MMP-2（~62 kDa）和MMP-9（~83 kDa）表达明显减弱，并且以活化的MMP-2条带减弱为主。这些结果提示，HATL4表达降低可能抑制MMP-2酶原的激活。
　　7．检测到HATL4过表达的CHO细胞上清中MMP-2酶原的激活显著增强，提示HATL4可能是通过激活pro-MMP-2生成MMP-2发挥其蛋白水解功能，降解基底膜，增强肿瘤细胞的侵袭性。同时明胶酶谱实验也证实有活化的MMP-2生成。
　　结论：在体外细胞实验中，HATL4的表达不改变AML来源的THP-1细胞的增殖和侵袭，但能增强AML来源的THP-1细胞侵袭Matrigel以及降解明胶的能力。我们的结果还提示，HATL4可能是主要通过激活pro-MMP-2，从而增强肿瘤细胞降解基底膜的侵袭能力。
　　第三章：HATL4在小鼠肿瘤模型中的生物学研究
　　目的：在第一章中，我们发现蛋白酶HATL4在AML细胞中异常高表达，而且HATL4的表达与AML病人治疗后预后不良相关，提示HATL4在AML的发病机制中起重要作用。在第二章中，我们发现HATL4能够增强AML来源的THP-1细胞侵袭Matrigel的能力。另外，我们通过明胶酶谱等实验发现 HATL4可能是通过激活MMPs，尤其是 MMP-2，从而促进细胞基底膜降解，增强肿瘤细胞的侵袭性。为了进一步证实我们的发现，在本章研究中，我们选用裸小鼠作为研究对象，将上述对照组、干扰组和恢复组细胞进行小鼠皮下荷瘤试验，观察成瘤大小，从体内水平来研究HATL4对肿瘤细胞增殖、凋亡和血管生成等能力的影响，探讨HATL4在AML发生发展中的作用及潜在机制。
　　方法：
　　1．将上述对照组、干扰组和恢复组THP-1细胞扩增培养后，皮下接种六周龄雄性裸小鼠后肢内侧，定期观察各组成瘤情况，测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。2．用免疫组织化学法对瘤组织细胞进行Ki-67和CD34染色，分别检测瘤组织中细胞增殖和血管表达情况。
　　3．通过脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL），对三组裸鼠肿瘤组织切片进行细胞凋亡检测。
　　结果：
　　1．接种第10天后，可以观察到裸小鼠后肢内侧肿瘤形成。第24天后，干扰组细胞（shH1和 shH2）接种的小鼠肿瘤增长速度显著低于相应的其它两组。第36天后，小动物活体成像观测到荧光信号出现在肿瘤接种部位。在干扰组小鼠，肿瘤荧光信号较弱，且成瘤体积小，平均肿瘤体积和重量均明显小于其它两组。
　　2．与相应的对照组和恢复组相比，干扰组小鼠肿瘤组织切片中Ki-67阳性细胞数明显减少。这一结果提示抑制HATL4的表达降低了THP-1细胞在小鼠体内的增殖能力。因此HATL4在体内可能通过促进THP-1细胞的侵润和增殖能力而发挥促肿瘤生长的效应。
　　3．在三组裸鼠肿瘤组织切片中，计数各500个细胞中TUNEL阳性细胞数，统计结果显示三组阳性率没有显著性差异，提示干扰组的 THP-1细胞在裸鼠瘤组织中细胞凋亡没有发生明显改变。因此，移植瘤在干扰组裸鼠体內生长速度减缓以及瘤体积的减小并不是由于细胞凋亡增加而引起的。
　　4．用血管标记物CD34对瘤组织血管进行染色并统计，发现三组的瘤组织血管数量没有明显差异，提示HATL4的表达与否并不影响THP-1细胞移植瘤内血管的生成。因此，THP-1细胞在裸鼠体内的成瘤机制和生长速度与血管生成没有直接关系。
　　结论：在裸鼠体内肿瘤模型中，HATL4可以促进THP-1来源的肿瘤细胞增殖，加快肿瘤生长速度。这一结果提示，HATL4可能参与AML的病理过程，促进AML的发生发展。
　　总之，我们首次发现II型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4在AML初诊病人中异常高表达，提示HATL4可以成为一个诊断AML新的生物标志物。我们的结果也显示AML患者治疗后骨髓细胞中HATL4的表达与MRD和预后等级呈显著相关。因此，HATL4在AML骨髓细胞中的异常高表达，有望应用于AML的临床早期诊断、靶向治疗及预后评估。在HATL4的作用机制方面，我们发现HATL4能激活MMPs，特别是MMP-2，通过降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭和生长而参与AML发生发展的病理过程。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

蛋白酶在肿瘤中的作用

II型跨膜丝氨酸蛋白酶

急性髓细胞性白血病

人气道胰蛋白酶样蛋白酶4（Human airway trypsin-like protease 4，HATL4）

参考文献

第一章：HATL4在急性髓细胞性白血病中的表达及预后相关性

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二章：HATL4的肿瘤细胞生物学体外研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三章：HATL4在小鼠肿瘤模型中的生物学研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

总 结

综 述:II型跨膜丝氨酸蛋白酶在肿瘤中的研究进展

缩略词表

博士学位期间发表的论文

本课题所获得基金资助

致谢