TROP-2基因对人结肠癌细胞侵袭及上皮间质表型转化的影响

摘要

目的：1.观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2（TROP-2）与上皮间质表型转化（EMT）相关蛋白（E-钙黏蛋白,波形蛋白）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白在结直肠癌组织中表达情况，并探讨它们之间的相关性及临床意义；2.研究 TROP-2基因过表达对结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭、EMT的影响；3.探讨TROP-2调控EMT的分子机制。
　　方法：1.收集行手术切除且随访满5年的结直肠癌患者组织标本80例。全部病例术前均未行化疗、放疗及靶向治疗。应用免疫组化法检测标本中TROP-2与EMT相关蛋白及MMP-9蛋白的表达情况，分析它们与各临床病理参数间的关系，探讨TROP-2与 EMT相关蛋白及 MMP-9蛋白的相关性。2.将 TROP-2慢病毒载体转染结肠癌SW480细胞，分别以未处理组为空白对照组（Con-A），以不包含TROP-2的为空载对照组（Con-B）。收集各组细胞，分别采用定量PCR和Western Blot方法检测TROP-2、E-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9的基因和蛋白；采用显微镜观察细胞形态学变化；采用平板克隆方法检测癌细胞增殖情况，分别采用划痕修复试验和Transwell方法检测癌细胞迁移和侵袭力情况。3.为进一步探讨 TROP-2分子机制，采用核因子κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷铵（PDTC）处理TROP-2过表达细胞株，以未用PDTC处理的慢病毒TROP-2组作为对照，分别采用定量PCR和Western Blot方法检测癌细胞E-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9基因和蛋白水平。
　　结果：1.TROP-2，E-钙黏蛋白,波形蛋白和 MMP-9蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为81.25％，16.25%，48.75%和72.5%。结直肠癌组织中，TROP-2表达与肿瘤的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移及5年生存率相关（P<0.05）；E-钙黏蛋白表达与肿瘤部位、浸润深度及5年生存率相关（P<0.05）；波形蛋白表达与肿瘤的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移及5年生存率相关（P<0.05）；MMP-9表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及5年生存率相关（P<0.05）。结直肠癌组织中，TROP-2与波形蛋白及MMP-9在结直肠癌组织中的表达呈正相关（r=0.276，P<0.05；r=0.421，P<0.05），TROP-2与E-钙黏蛋白在结直肠癌组织中的表达呈负相关（r=-0.628，P<0.05）。2.与空白对照组和空载对照组比较，TROP-2慢病毒组TROP-2基因和蛋白水平明显升高；细胞形态学观察发现，TROP-2慢病毒组细胞变长，呈纺锤形，形态发生明显变化；空白对照组和空载转染组癌细胞呈鹅卵石形或多边形。提示癌细胞可能发生了EMT。定量PCR和Western Blot检测发现，与空白对照组和空载对照组比较，TROP-2慢病毒组波形蛋白和MMP-9基因和蛋白水平明显升高，而E-钙黏蛋白基因和蛋白水平明显降低；平板克隆方法发现，空白对照组、空载对照组和TROP-2慢病毒组克隆形成数分别为75±6、76±5和119±3（P<0.05）；划痕修复试验检测发现，空白对照组、空载对照组和TROP-2慢病毒组痕间间距分别为389±5（μm）、395±3（μm）和158±5（μm）（P<0.01）。Transwell方法检测发现，空白对照组、空载对照组和TROP-2慢病毒组侵袭细胞数分别为89±4、92±5和139±6（P<0.05）。3.采用NF-κB抑制剂PDTC处理TROP-2过表达细胞株后，定量PCR和Western Blot方法检测发现，与未用PDTC的慢病毒TROP-2组比较，波形蛋白和MMP-9基因和蛋白水平明显降低，而E-钙黏蛋白基因和蛋白水平明显升高。
　　结论：1. TROP-2与 EMT相关蛋白在结直肠癌组织中与侵袭转移密切相关。2. TROP-2通过诱导EMT发生，增强结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。3. NF-κB/MMP-9是TROP-2调控结肠癌细胞EMT的重要途径之一。

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前言

1.研究背景

2.课题着眼点和主要研究思路

第一部分 TROP-2与EMT相关蛋白及MMP-9在结直肠癌组织中表达的临床意义及相关性

材料与方法

结果

第二部分 TROP-2过表达对结肠癌细胞侵袭的影响及分子机制

材料与方法

结果

讨论

1.1结直肠癌相关发生发展机制

1.2癌细胞侵袭和转移中的EMT

1.3参与EMT的信号通路

1.4 TROP-2参与调控EMT

结论

参考文献

综述: 临床角度方面的上皮-间充质转化

附录

创新点

不足之处

英文缩写索引

攻读博士学位期间学术成果

致谢