STAT3-siRNA-前胸腺素α共负载热敏性纳米胶束对肿瘤相关树突状细胞免疫功能调控的影响

摘要

目的：将负载前胸腺素（ProTα）多肽片段，具有温度敏感性的聚合物胶束用于负载STAT3-siRNA到达肿瘤相关树突状细胞（TADCs），下调STAT3蛋白的表达，调控肿瘤相关树突状细胞的功能，发挥其体内免疫抗肿瘤效果。
　　方法：通过酰胺键反应合成壳聚糖接枝的泊洛沙姆（PO-CS）载体，采用FT-IR和1H-NMR进行结构验证，并用芘探针测量其形成胶束后的临界胶束浓度。在溶液中形成胶束后，利用马尔文粒径电位测定仪中测量其粒径和电位大小，同时测量15℃，25℃和37℃条件下胶束的粒径变化考察其温度敏感性。本实验还分别测量了泊洛沙姆（PO）、壳聚糖（CS）以及 PO-CS载体在不同温度下的粒径变化情况来考察该胶束的温度敏感性来源。将制备好的胶束置于透射电镜（TEM）中观察其表面形态，并通过琼脂糖凝胶电泳验证胶束对siRNA的保护作用。利用MTT的方法考察胶束对树突状细胞（DCs）、脾脏细胞（Spleen Cells）和293T细胞的安全性；并使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察PO-CS胶束负载ProTα和siRNA进入DCs的情况及聚合物胶束温度敏感性的考察。利用Western Blot方法检测负载STAT3胶束与TADCs共培养后STAT3蛋白的下调情况，同时使用流式细胞仪检测STAT3-siRNA发挥沉默效果后，ProTα促进TADCs表达CD40，CD86及IL-12的情况。采用IVIS Lumina II小动物成像仪观察胶束负载Cy5-siRNA的体内动态情况，使用红外热成像仪考察胶束体内冷刺激所需的时间。建立 B16黑色素瘤肿瘤模型考察负载 ProTα和STAT3-siRNA的ProTα-PO-CS载体的体内药效学效果。
　　结果：本实验所构建 PO-CS载体容易形成胶束，CMC较低（5.0μg/ml）。TEM结果表明，PO-CS胶束外观圆整，粒径为231.7±4.6nm，电位为17.3±0.3mV，PI值较小，对siRNA的包封率达90％以上，且具有一定的温度敏感性。MTT结果显示，PO-CS胶束的DCs细胞毒性低，并且其负载的siRNA在树突状细胞中的摄取（81%）要比巨噬细胞（25%）高。激光共聚焦显微镜结果表明，ProTα/PO-CS胶束能很好地将siRNA转运到TADCs中，并且具有很好的温度敏感性，能在冷刺激的作用下实现siRNA的释放。Western Blot结果表明，胶束负载的STAT3-siRNA能有效沉默TADCs中STAT3蛋白的表达，并且能在流式细胞仪中观察到ProTα促进TADCs中表面成熟因子CD40，CD86的上调，而未加 STAT3-siRNA处理组并无此功能。该结果表明共负载STAT3-siRNA和ProTα处理后，TADCs的功能得到恢复，能向成熟树突状细胞分化。IL-12因子的上调结果也证明经共负载 STAT3-siRNA和 ProTα胶束治疗后，TADCs恢复正常的功能。体内小动物成像结果表明，胶束负载 siRNA后，持续长时间观察到 Cy5-siRNA的体内动态情况。红外热成像结果表明，体内达到冷刺激效果温度所需的时间为20-25min。体内肿瘤生长抑制实验结果表明，与PBS组相比，负载ProTα和STAT3-siRNA的ProTα-PO-CS冷刺激胶束组能很好地调控TADCs的功能，发挥免疫抗肿瘤效果，抑制肿瘤的生长，同时释放更多的IL-12，共同抑制肿瘤的生长。
　　结论：ProTα-PO-CS温度敏感性胶束能将siRNA递送到TADCs中，沉默STAT3蛋白的表达，调控TADCs的功能，恢复ProTα促进树突状细胞向成熟树突状细胞分化的功能，发挥联合免疫抗肿瘤的治疗效果。

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第一章 文献综述

1树突状细胞（DCs）

2肿瘤相关树突状细胞（TADCs）

3 TLR激动剂与ProTα

4 siRNA干扰技术

5温度敏感性载体

6本研究的意义和目的

第二章 壳聚糖接枝泊洛沙姆载体的合成及结构表征

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3实验结果

4本章小结

第三章 ProTα-PO-CS胶束的制备及评价

1实验材料与仪器

2. 实验方法

3实验结果

4本章小结

第四章 ProTα-PO-CS纳米胶束体外细胞学评价

1实验材料与仪器

2.实验方法

3实验结果

4 本章小结

第五章 ProTα-PO-CS温敏性纳米胶束体内组织分布及药效学评价

1实验材料与仪器

2实验方法

3实验结果

4本章小结

全文总结

参考文献

本文所用到中英文缩写对照

致谢