表观遗传调控对骨癌痛大鼠痛觉过敏与认知障碍以及BDNF介导的突触可塑性的影响

摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　第一部分 腰硬联合穿刺技术用于改良大鼠鞘内置管术
　　目的:
　　大鼠鞘内置管与给药技术在神经科学和疼痛研究中是一项重要的实验方法。该技术自被报道以来不断被加以改进，但是多年来经验提示仍然有许多缺陷未被有效解决。
　　方法:
　　我们通过对标准硬膜外穿刺针和腰麻穿刺针进行简单改造，开发出一种类似腰硬联合麻醉“针中针”技术的大鼠鞘内置管方法。首先通过腰部皮肤切口将硬膜外针插入皮下，顶端抵达椎间孔;然后在硬膜外针中插入腰麻针，并在黄韧带和珠网膜上钻孔;最后通过硬膜外针体上的侧孔将PE-10导管置入蛛网膜下腔。为了与传统置管方法比较，椎板切除法（对照组）或我们的改良技术（改良组）被用于大鼠鞘内置管。记录两组手术时间、成功率及术后并发症的发生率。分别在术前1天和术后第1～3和5、7、14、21天测量大鼠热缩爪潜伏期、机械缩爪阈值和运动功能变化，以评估鞘内置管对神经功能的影响。
　　结果:
　　我们的改良方法与椎板切除法相比，更加简单方便，具有较少的手术创伤，较好的位置精确性，更牢固的导管固定，较小的死亡率。手术本身没有干扰行大鼠神经行为学和运动协调。
　　结论:
　　该改良鞘内置管方法可较好地用于有关脊髓部位的神经行为学和药理学研究。
　　第二部分 HDAC和HAT抑制剂对骨癌痛大鼠痛觉过敏和BDNF介导的突触可塑性的影响
　　目的:
　　癌性疼痛对癌症患者产生不利影响，在临床上通常很难得到有效治疗。我们的既往研究表明，从脊髓小胶质细胞释放的脑源性神经营养因子(BDNF)对于骨癌接种诱导的大鼠痛觉过敏是必需的。BDNF是一个重要的表观遗传靶基因，受组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)酶之间平衡的调节。BDNF的组蛋白乙酰化调控在骨癌痛发生发展中的作用还知之甚少。因此，本研究的目标是探讨HAT抑制剂-姜黄素(CUR)和HDAC抑制剂-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对痛行为学和脊髓背角BDNF和突触素1(SYN1)表达的影响。
　　方法:
　　40只雌性SD大鼠随机分为5组:对照组、骨癌痛+溶媒组、骨癌痛+SAHA25μg组、骨癌痛+SAHA5μg组、骨癌痛+SAHA1μg组。大鼠左胫骨上端注入Walker256细胞制备骨癌痛模型。建模后第6～8天，SAHA各剂量组大鼠分别鞘内注射相应剂量的SAHA;溶媒组鞘内注射5％ DMSO20μl。分别于术前及术后第1～18天测定大鼠机械缩足阈值(PWT)。另取32只雌性SD大鼠随机分为4组:假手术对照组(SHAM)、骨癌痛+溶媒组(VEH)、骨癌痛+SAHA组(SAHA)、骨癌痛+CUR组(CUR)。在大鼠建模后第6～8天，SAHA组大鼠腹腔注射SAHA50mg/kg，CUR组大鼠腹腔注射CUR50mg/kg，VEH组大鼠腹腔注射相同容量的DMSO，1次/天，连续3天。机械痛阈值测定同前。另取48只雌性大鼠，分组和处理同前。在造模后第9天，各组分别取4只大鼠进行免疫荧光双标染色、Western blots和Real-timePCR实验以检测BDNF、SYN1、acH3K9和acH4K16在脊髓组织表达。
　　结果:
　　造模后6-18天，大鼠机械痛阈值显著降低。鞘内注射不同剂量的SAHA组呈剂量依赖性地提高PWT值。免疫荧光双标显示BDNF分别与神经元和小胶质细胞共表达，而ACH3k9、ACH4k16和SYN1只存在于神经元。接种后6～8天连续腹腔注射SAHA能够逆转BCP诱导的机械痛敏，增加H3K9和H4k16的乙酰化，减少脊髓背角BDNF/SYN1的表达。应用CUR对大鼠机械痛阈和BDNF/SYN1表达没有显著影响。
　　结论:
　　HDAC抑制剂以一种间接的方式下调骨癌痛大鼠脊髓BDNF/SYN1表达，而发挥抗痛觉过敏作用。
　　第三部分 表观遗传调控对骨癌痛大鼠认知障碍和海马组织BDNF/SYN1表达的影响
　　目的:
　　既往研究表明，长期慢性疼痛刺激通过下调BDNF表达对学习记忆产生显著影响。BDNF是一个重要的表观遗传调控靶基因。本研究采用大鼠骨癌痛动物模型，观察HAT抑制剂-姜黄素(CUR)和HDAC抑制剂-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)治疗对骨癌接种后认知功能和海马组织BDNF/SYN1表达的影响，旨在为预防癌痛诱发的认知功能障碍提供实验依据。
　　方法:
　　28只雌性SD大鼠随机分为7组:正常对照组、假手术组和造模后第3、6、12、18天组。于大鼠左胫骨上端注入Walker256细胞制备骨癌痛模型。Western blots检测每个时间点海马组织BDNF/SYN1表达量。另取4只大鼠在造模后第12天组行BDNF、SYN1、acH3k9和acH4K16分别与神经细胞标记物(GFAP、OX42、NeuN)的免疫荧光双标染色。另有32只雌性SD大鼠随机分为4组:假手术对照组(SHAM)、骨癌痛+溶媒组(VEH)、骨癌痛+SAHA组(SAHA)、骨癌痛+CUR组(CUR)。在造模后第10～13天，VEH组、SAHA组和CUR组分别腹腔注射相应的药物，1次/天，连续4天。Morris水迷宫实验和神经认知功能评分被用来测量大鼠空间学习记忆能力。Western blots或Real-time PCR用来检测海马组织BDNF/SYN1表达。
　　结果:
　　海马SYN1/BDNF在造模后3天有一个升高的过程，之后则迅速下降。免疫荧光结果显示，海马组织BDNF和acH3K9主要分布于小胶质细胞。在造模后第11～13天（水迷宫实验第2～4天），VEH组大鼠隐藏平台潜伏期和游泳距离平均值与SHAM组相比显著延长。连续4天应用SAHA能显著逆转这一趋势。在参照记忆任务中，SAHA组与VEH组比较，在目标象限所花费的时间百分比显著增加。在造模后14天，SAHA能够显著改善骨癌痛诱导的海马组织BDNF\SYN1表达的下调。CUR治疗组与VEH组相比并没有显著差异。
　　结论:
　　骨癌痛可导致大鼠认知功能障碍，可能与海马BDNF/SYN1的表达下调有关。而SAHA可以通过表观遗传机制上调BDNF/SYN1表达而改善骨癌痛大鼠的学习记忆能力。

目录

声明

摘要

第一部分 腰硬联合穿刺技术用于改良大鼠鞘内置管术

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 HDAC和HAT抑制剂对骨癌痛大鼠痛觉过敏和BDNF介导的突触可塑性的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 表观遗传调控对骨癌痛大鼠的认知障碍和海马组织BDNF／SYN1表达的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论和展望

综述：Epigenetic modification and chronic pain

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