长链非编码RNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移及成血管功能的调控及机制研究

摘要

下肢深静脉血栓形成（Deep vein thrombosis，DVT）是临床上常见的外周血管性疾病，每年的发生率在0.1％至0.27%之间。下肢DVT的治疗主要包括①早期预防症状性肺动脉栓塞、阻止血栓的蔓延和减轻下肢水肿及疼痛等症状；②及时清除血栓，包括药物溶栓、手术切开取栓术；③长期抗凝预防深静脉血栓复发以及减少血栓后综合征（Post-thrombosis syndrome, PTS）的发生。PTS是DVT的长期并发症，即使DVT患者接受规范化抗凝治疗，2年后PTS的发生率仍高达20%～50%，5年后有约15%的患肢出现溃疡，静脉性跛行的发生率高达40%，约15%的病人出现行走困难，100%的病人生活质量受到了影响。目前临床上针对PTS的治疗手段有限且治疗效果较差，因此，深入研究DVT发生发展过程中的分子机制，寻找早期诊断、安全高效的生物治疗手段及效果确切的预后评价新方法，将为患者带来福音，也是国家科技攻关的需要。干细胞治疗作为新兴的科学技术，是一种富有前景的治疗策略，为各种难治性疾病的治愈带来了新的希望。目前在心血管疾病中已取得了一些可喜的临床前及临床研究成果，将干细胞应用于DVT的治疗及PTS的预防将是一个新的治疗方向，深入研究提高干细胞治疗效果具有重大的临床意义。
　　内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是主要存在于人骨髓中的多能干细胞，研究发现DVT后24h循环中的EPCs明显增加，于48h后达到高峰，动员的EPCs从骨髓中被释放到微静脉内，进而归巢到血栓部位，在血栓的再通过程中起着重要作用，尤其是在血栓中的血管新生和对内皮修复两个方面。但EPCs从骨髓中动员归巢到缺血部位的数量有限，且循环中的EPCs易受到多种因素（如年龄、吸烟和糖尿病等）的影响，使EPCs的数量及功能受到影响。因此，如何提高EPCs的归巢和成血管能力显得尤为重要。
　　本实验首先通过密度梯度离心法分离出人外周血来源的单个核细胞，应用EGM-2 MV培养基体外培养，培养出细胞通过细胞形态、表面标志物检测及双荧光染色等方法进行鉴定。通过前期的lncRNA基因芯片检测结果中找到一个差异表达的lncRNA WTAPP1，应用慢病毒技术上调和下周此lncRNA的表达，CCK8法检测lncRNA WTAPP1对EPCs增殖能力的影响、划痕实验及侵袭实验检测lncRNA WTAPP1对EPCs迁移能力的影响、成血管实验检测lncRNA WTAPP1对EPCs血管新生作用的影响。再通过生物信息学分析找到lncRNA WTAPP1的靶向调控分子金属蛋白酶1（metal matrix proteinase1, MMP1），MMP1在细胞的迁移及血管新生过程中起着重要作用。通过 miRNA基因芯片技术筛选出差异表达且促进 EPCs功能的miRNA，同时验证这个 miRNA与 MMP1的调控关系，同时我们还进一步验证此lncRNA与自噬、Akt/PI3K/mTOR信号通路之间的联系。
　　上述研究结果为下一步的提高EPCs功能的研究奠定了理论基础，并可能为EPCs移植治疗DVT及缺血性疾病的临床研究提供重要的实验依据，为DVT的临床治疗提供新的思路和方法。
　　本实验研究分为三部分，下面就研究目的、方法、结果、结论作如下分述。
　　第一部分人外周血来源内皮祖细胞的分离、培养和鉴定
　　目的：采用密度梯度离心法分离、培养和鉴定人外周血来源的内皮祖细胞，为进一步的实验研究提供符合条件的工具细胞。
　　方法：收集健康成人外周血60ml，密度梯度离心法分离单个核细胞，接种到Ⅰ型胶原包被的六孔板中，应用含有多种生长因子的EGM-2MV培养基，培养7天后对培养基半换液，细胞融合至90%以上时进行细胞传代。并通过普通光学显微镜下观察细胞形态学特征，流式细胞技术及Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色检测对原代细胞进行鉴定。
　　结果：细胞呈集落样生长，呈多边形、梭形或卵圆形，培养至第2-3代的细胞呈典型的铺路石样生长。细胞形态学上符合典型EPCs的特点。双荧光染色结果显示：细胞具有吞噬DiI-Ac-LDL并能结合FITC-UEA-1的功能。对细胞表面标志分子CD31、CD34、CD45、CD133、CD309进行流式细胞术检测，结果符合EPCs表面标志分子的特征。
　　结论：本实验通过密度梯度离心法分离出人外周血来源的单个核细胞，通过含有多种生长因子的EGM-2 MV培养基进行培养，其形态学上符合EPCs生长特点，能够吞噬DiI-Ac-LDL且能够结合FITC-UEA-1，流式细胞术检测抗原CD31、CD34、CD45、CD133、CD309，结果符合典型EPCs的表面标志物的特点，此类细胞可以满足后续实验的需要。
　　第二部分长链非编码RNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移与成血管功能的调节作用
　　目的：探索lncRNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移及成血管功能的调控作用。
　　方法：1.合成lncRNA WTAPP1 siRNA及过表达lncRNA WTAPP1的慢病毒，用慢病毒感染EPCs，荧光显微镜下观察感染效率，qRT-PCR检测lncRNA WTAPP1调控的效果；
　　2.细胞分组：正常EPCs、空病毒感染EPCs、lncRNA WTAPP1 siRNA慢病毒感染的EPCs及过表达lncRNA WTAPP1慢病毒感染的EPCs；
　　3. CCK8法检测四组EPCs的增殖能力变化；
　　4.划痕实验及侵袭实验检测四组EPCs中迁移能力的变化；
　　5.体外Matrigel胶成血管实验及体内基质胶栓实验检测四组EPCs的成血管能力；
　　结果：1.合成的慢病毒感染EPCs后，感染效率大于90%，qRT-PCR检测lncRNA WTAPP1表达的结果提示慢病毒感染EPCs调控效果稳定可靠；
　　2.CCK8法检测细胞增殖能力结果发现各组细胞的吸光度无明显差异，P>0.05，无统计学意义，提示lncRNA WTAPP1对EPCs的增殖无明显影响；
　　3.划痕实验结果：lncRNAWTAPP1siRNA干扰组较空病毒组划痕区迁移细胞数量明显减少（116.7±19.9 VS182.0±13.7，P<0.01），二者具有统计学差异；lncRNA WTAPP1过表达组划痕区迁移细胞数量较空病毒感染组明显增加（249.0±28.0 VS182.0±13.7， P<0.01），二者同样具有统计学差异。
　　侵袭实验结果：lncRNA WTAPP1 siRNA干扰组较空病毒组侵袭的细胞数量明显减少（18.7±2.5 VS33.0±2.0，P<0.001），二者具有统计学差异； lncRNA WTAPP1过表达组 Transwell小室膜下迁移细胞数量较空病毒感染组明显增加（45.7±4.2 VS33.0±2.0，P<0.01），二者具有统计学差异。
　　4.体外Matrigel胶成血管实验提示lncRNA WTAPP1 siRNA慢病毒感染的EPCs的成血管能力较空病毒组明显降低（28.5±4.8 VS43.5±3.7，P<0.001），而lncRNA WTAPP1过表达组的EPCs成血管能力增加（63.3±5.0VS43.5±3.7，P<0.001），差异均具有统计学意义。体内基质胶栓实验提示lncRNA WTAPP1 siRNA慢病毒感染的EPCs的成血管面积占总面积的比例较空病毒组明显减少（0.30±0.04 VS0.43±0.09， P<0.05），而lncRNA WTAPP1过表达组的EPCs成血管能力增加（0.75±0.05VS0.43±0.09，P<0.001），差异均具有统计学意义，
　　结论：上调lncRNA WTAPP1的表达可提高EPCs的迁移及成血管功能，反之，下调lncRNA WTAPP1的表达可抑制EPCs的这些功能。
　　第三部分长链非编码RNA WTAPP1调节内皮祖细胞迁移与成血管功能的机制研究
　　目的：探索lncRNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移及成血管功能的调控机制。
　　方法：1. qRT-PCR检测lncRNA WTAPP1对MMP1表达的影响:细胞分为正常EPCs、空病毒感染EPCs、lncRNA WTAPP1 siRNA感染EPCs及过表达lncRNA WTAPP1感染的EPCs四组，qRT-PCR检测各组EPCs中MMP1的表达量；
　　2.Western blot法检测lncRNA对EPCs中MMP1蛋白表达的影响：细胞分为正常EPCs、空病毒感染EPCs、lncRNA WTAPP1 siRNA感染EPCs及过表达lncRNA WTAPP1感染的EPCs四组，Western blot检测各组EPCs中MMP1的蛋白表达量；
　　3.探索miRNA在lncRNA WTAPP1调控MMP1中的作用机制:
　　3.1通过miRNA基因芯片技术检测lncRNA WTAPP1 siRNA慢病毒稳转的EPCs中差异表达的miRNA；
　　3.2筛选与MMP1存在潜在靶向调节关系的miRNA；
　　3.3 qRT PCR验证表达差异的miRNA；
　　3.4合成miRNA minics及inhibitor慢病毒，感染EPCs细胞，检测慢病毒感染效率；
　　3.5通过qRT- PCR及Western blot验证miR-3120-5P对MMP1表达的调节作用；
　　3.6通过侵袭实验及成血管实验验证miR-3120-5P对EPCs迁移及成血管功能的影响；
　　4. LncRNA WTAPP1与miR-3120-5P表达量之间相关关系的探索：对lncRNA WTAPP1过表达的EPCs中miR-3120-5P及lncRNA WTAPP1的相对表达量进行Pearson相关分析；
　　5.探索lncRNA WTAPP1、MMP1 mRNA及miR-3120-5P三者间的关系：通过Blast比对lncRNA WTAPP1、 MMP1 mRNA及 miR-3120-5P三者的核苷酸序列，分析三者存在调控关系的分子基础；
　　6.通过lncRNA WTAPP1的CNC分析寻找相关的信号通路；
　　7. Akt/PI3K/mTOR信号通路在lncRNA WTAPP1对 MMP1调控机制中的作用：通过Western blot技术对lncRNA WTAPP1过表达及siRNA慢病毒感染的EPCs（以正常EPCs及NC慢病毒感染的EPCs作对比）中磷酸化的Akt、PI3K及mTOR的表达量变化。
　　8.自噬在lncRNA WTAPP1对MMP1调控机制中的作用探索：分别加入一种常用自噬促进剂雷帕霉素以及转染自噬关键蛋白Atg5的siRNA来促进和干扰细胞自噬来观察EPCs中MMP1的表达。从而探索自噬在lncRNA WTAPP1调节MMP1表达中所扮演的作用。
　　结果：1. qRT-PCR检测发现lncRNA WTAPP1 siRNA组的EPCs表达MMP1减少， P<0.001，差异具有统计学意义；Western blot检测MMP1蛋白合成也同样减少，P<0.05，差异具有统计学意义。Pearson相关分析结果提示现lncRNA WTAPP1与MMP1 mRNA的表达是呈正相关关系，P<0.05，具有统计学意义。
　　2. miRNA基因芯片检测发现了17个差异较大的(P<0.05)的miRNAs，其中3个表达上调，14个表达下调。MiR-3120-5p表达升高3.3倍，qRT-PCR检测验证结果与芯片结果一致，对lncRNA WTAPP1与miR-3120-5p的相对表达量进行Pearson相关分析发现lncRNA WTAPP1与miR-3120-5p存在着负相关关系，P<0.001，具有统计学意义。应用Target Scan7.0网站对miR-3120-5p与MMP1进行分析，发现在MMP13' UTR中的存在miRNA互补片段。
　　3.通过Blast比对分析miR-3120-5P与lncRNA WTAPP1、MMP1三者核苷酸序列，发现MMP1及lncRNA WTAPP1均与miR-3120-5P存在互补序列。
　　4. Western blot结果提示我们miR-3120-5P可抑制MMP1蛋白的合成。
　　5.侵袭实验结果：miR-3120-5P minics慢病毒感染组EPCs较空病毒组侵袭的细胞数量明显减少（24.7±3.5 VS38.0±6.2，P<0.01），二者具有统计学差异； miR-3120-5P inhibitor慢病毒感染的EPCs侵袭的细胞数量较空病毒感染的EPCs侵袭的细胞数量明显增加（59.0±4.6 VS38.0±6.2，P<0.01），二者具有统计学差异；
　　成血管实验结果：miR-3120-5P minics慢病毒感染的EPCs的成血管能力较空病毒组明显降低（20.7+4.0 VS30.3+2.5，P<0.05），而miR-3120-5P inhibitor慢病毒感染的EPCs成血管能力增加（41.3+4.1 VS30.3+2.5，P<0.01），差异均具有统计学意义
　　6.对lncRNA WTAPP1进行CNC分析发现与其具有相同表达模式的mRNA大多参与细胞的分化及成血管功能，这些mRNA多与Akt/PI3K信号通路及自噬相关。
　　7. LncRNA WTAPP1 siRNA慢病毒感染组EPCs中Akt、PI3K和mTOR蛋白的磷酸化水平降低，反之，lncRNA WTAPP1过表达的EPCs中Akt、PI3K和mTOR蛋白的磷酸化水平升高。
　　8.过表达lncRNA WTAPP1的EPCs中LC3B及Atg5表达降低，而P62表达升高，相反，lncRNA WTAPP1表达低的EPCs中LC3B及Atg5表达升高，但P62表达降低。
　　结论：LncRNA WTAPP1促进EPCs的迁移及血管新生的机制包括：lncRNA WTAPP1通过抑制miR-3120-5P和自噬来促进MMP1的表达，后者在细胞迁移及血管新生过程中起着重要的作用；Akt/PI3K/mTOR信号通路的活化在其中起着重要作用。

目录

声明

引言

第一部分 人外周血来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分长链非编码RNA WTAPP1对内皮祖细胞迁移与成血管功能的调节作用

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分长链非编码RNA WTAPP1调节内皮祖细胞迁移与成血管功能的机制探索

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

研究创新与不足

一、研究创新：

二、研究不足：

英文缩略词表

综述:内皮祖细胞促进深静脉血栓形成的溶解

攻读学位期间学术成果

致谢